第二节 临床实验室基本技术

一、实验室纯水

（一）定义

根据我国卫生行业标准WS/T574—2018，纯水（pure water）是指不含杂质的水。在临床实验室，纯水是指纯水设备以反渗透、蒸馏、离子交换等方法制备的去离子水，不含任何添加剂，其电导率通常< 1.0mS/m（25℃），即电阻率> 0.1MΩ·cm（25℃）（参考行业标准的数据）。

（二）级别

纯水是在临床实验室检查过程中试剂、缓冲液和稀释剂的主要成分。纯水被用于清洗仪器和实验室器皿以及高压蒸汽消毒时的残留部分，也可成为试验的间接成分，因此纯水也是实验室检查结果错误的潜在原因之一。不同的实验需求，所使用的纯水也有所不同。根据我国分析实验室用水的国家标准《分析实验室用水规格和方法》（GB/T 6682—2008），分析实验室的原水应为饮用水或适当纯度的水。分析实验室用水共分为三个级别：一级水、二级水及三级水（表2-1）。

一级水用于有严格要求的分析实验，包括对颗粒有要求的实验，如高效液相色谱分析用水。一级水可用二级水经过石英设备蒸馏或离子交换混合床处理后，再经0.2μm微孔滤膜过滤来制取。

二级水用于无机痕量分析等，如原子吸收光谱分析用水。二级水可用多次蒸馏或离子交换等方法制取。

三级水用于一般化学分析实验。三级水可用蒸馏水或离子交换等方法制取。

（三）国内实验室用水的种类

国内实验室用水通常可分为蒸馏水、去离子水、反渗水、超纯水四个种类。

1.蒸馏水

蒸馏水（distilled water）是指将水蒸馏、冷凝的水。经两次蒸馏的水称双蒸水，经三次蒸馏的水称三蒸水。将自来水（或天然水）在蒸馏器中进行加热汽化，水蒸气经冷凝后得到蒸馏水，其在25℃时其电阻率为1×105Ω·m左右。蒸馏水能去除自来水内大部分的污染物，但挥发性的杂质无法去除，如CO₂、NH₃、SiO₂及一些有机物。初制备的蒸馏水是无菌的，但储存后细菌易繁殖。实验室多使用不锈钢、聚偏氟乙烯、玻璃纤维强化树脂等材料制成的容器进行储存。蒸馏水常用于玻璃器皿的清洗，高压灭菌器、恒温恒湿实验箱和清洗机用水。蒸馏水虽然制备简单，但耗能、耗水且产水速度慢，应用逐渐减少。

2.去离子水

去离子水（deionized water）是指经过阴阳离子交换树脂床，去除水中阴、阳离子所得到的水，去离子水纯度较高，25℃时电阻率达5×106Ω·m以上。离子交换树脂法能有效地去除杂质离子，但无法去除大部分的有机物和微生物，因此去离子水存放后容易引起细菌的繁殖，且可以污染离子交换柱从而降低其制备功效。去离子水作为生化反应的载体或介质、样品或试剂的稀释液和溶剂、仪器的清洗液甚至反应的参与者等贯穿检测的全过程。

3.反渗水

反渗水（reverse osmosis water）是通过反渗透法制备得到的纯水。反渗透法是试剂级纯水系统最好的前处理方法。使用一个高压泵对高浓度溶液提供比渗透压差大的压力，迫使水通过半透膜而被收集的水称为反渗水。反渗透膜的滤孔结构较超滤膜致密，可去除所有的颗粒、细菌以及分子量大于300的有机物（包括致热源），因此反渗水克服了蒸馏水和去离子水的许多缺点，有效地去除水中的溶解盐、胶体、细菌、病毒、细菌内毒素和大部分有机物等杂质。但需要注意的是不同厂家生产的反渗透膜对反渗水的质量影响很大。反渗水主要用于无机痕量分析等实验，如原子吸收光谱用水，或用于一般的化学检验实验。

4.超纯水

超纯水（ultrarpure grade water）一般指经离子交换树脂、活性炭、滤膜法去除水中的主要不纯物质，电阻率值可达到18.3×106Ω·cm（25℃）的水。人们生产的纯水达不到理论值，但可以达到18.0×106Ω·cm，对于这种水，有的称为高纯水，有的称为超纯水，目前还没有系统的定义，也没有划分等级界限。超纯水的制备方法有蒸馏法、反渗透法、离子交换法、过滤法、吸附法、紫外氧化法等。超纯水一般采用超纯水机制备。超纯水机一般可以将水的纯化过程大致可以分为四步：预处理（初级净化）、反渗透（生产出纯水）、离子交换（可生产出18.3×106Ω·cm超纯水）和终端处理（生产出符合特殊要求的超纯水）。超纯水既无离子也无微生物，可用于分子克隆、DNA测序、细胞培养等各种精细实验。

二、化学试剂

化学试剂有不同的等级规格，各自的纯度和用途也不尽相同，参照进口化学试剂的质量标准，我国将化学试剂（通用试剂）分为四个等级。

（1）一级——优级纯（G.R），又称保证试剂，绿色标签，该级别纯度最高、杂质含量最低，适用于科研和配制校准溶液。

（2）二级——分析纯（A.R），又称分析试剂，红色标签，该级别纯度较高、杂质含量较低，适用于定性和定量分析。

（3）三级——化学纯（C.P），蓝色标签，该级别质量略低于二级品，适用于一般定量分析和定性实验。

（4）四级——实验试剂（L.R），黄色标签，该级别试剂质量较低，但比工业用高，适用于一般定性实验。

生化检验一般选择三级或三级以上的试剂，若需要准确的定量分析或配制校准溶液则必须选用二级以上的化学试剂。

另外，还有光谱纯试剂（S.P）、层析纯试剂（ch.p）等，指用光谱法、层析法等测不出杂质含量，主要作为相应分析的基准物质。

三、生物制剂

生物制剂是应用传统技术或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物源和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品，包括疫苗、菌苗、类毒素、免疫血清、血液制剂、诊断用品、噬菌体等。

（一）生物制剂的分类

（1）疫苗等预防类生物制剂：

细菌类疫苗、病毒类疫苗、类毒素和联合疫苗。

（2）抗毒素及免疫血清：

由特定抗原免疫动物所得血浆制成的抗毒素或免疫血清，如破伤风抗毒素、狂犬疫苗血清等，用于治疗或被动免疫预防。

（3）血液制剂：

如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重组）、红细胞浓缩物等。

（4）细胞因子及重组DNA产品：

如干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、集落刺激因子（CSF）、红细胞生成素（EPO）等。

（5）诊断制剂：

包括体内诊断制品和体外诊断制剂。

（二）生物制剂的特殊性及潜在风险

生物制剂拥有蛋白质独特的多维结构，分子量通常是化学小分子的100~1 000倍。蛋白质是非常不稳定的分子，蛋白质的结构并非只由编码的DNA序列决定，还会受其生产的细胞和生产过程的影响，为了达到特定的生物活性，蛋白质必须三维折叠形成准确的二级、三级和四级结构，其结构与功能之间的关系是不清楚或至少是不完全清楚的。不同的生物制剂蛋白质的多维结构不同，因此生物制剂的作用方式无法准确复制，即使分子式相同，且通过相同的细胞或微生物生产，也可能导致不同的疗效和安全性。

生物制剂来源于各种生物体内，具有免疫原性，其药效、药动学特征及毒性在不同个体中差异很大，直接关系到用药安全，潜在威胁较大。

（三）生物制剂的储存与运输

（1）生物制剂的储存：

生物制剂对温度、光照等非常敏感，必须严格按照药品说明书规定的环境条件储存，如属于高危药品的生物制剂须有专门的存放位置，并设警示标识。大部分生物制剂储存流通要求为2~8℃，如血清、菌苗、类毒素、球蛋白、白蛋白等。任何储存条件的细微变化都可能会影响生物制剂的特性及安全性。多数活湿苗，只能现制现用，在0~8℃下仅可短时期保存；灭活苗、血清、诊断液等保存在2~15℃，不能过热，也不能低于0℃；冻结苗应放在-70℃以下的低温条件下保存。工作中必须坚持按规定温度保存，不能任意放置，防止高温存放或温度忽高忽低，以损害生物制剂的质量。

（2）生物制剂的运输：

不论用何种运输工具运送生物制剂，均需注意防止高温、暴晒和冻融。运送时，药品要逐瓶包装，衬以缓冲物如厚纸或软草然后装箱。如果需要低温保存，可先将药品装入盛有冰块的保温瓶或保温箱、冷藏车内运送。运送过程中，避免高温和直射阳光。北方寒冷地区要避免药品冻结，尤其要避免由于温度高低不定而引起的反复冻结和融化。

（四）生物制剂使用的基本原则

（1）应严格按照药品说明书的适应证和医疗保险的有关规定合理应用。

（2）应严格按照药品说明书规定的用法用量，并结合患者的实际情况拟订给药方案。

（3）生物制剂应单独使用，严禁与其他药品混合、配伍使用。

（4）应高度重视并注意观察生物制剂可能出现不良反应的情况。

（5）生物制剂的瓶底有裂纹、标签不清、过期失效或者存在液体变色、有摇不散的异物和絮状物时严禁使用。

四、质控品、标准品和参考物质

（一）质控品

质控品是专门用于质量控制目的的标本或溶液，对稳定性、瓶间差要求高，不能用于校准。质控品分定值质控品和不定值质控品两种。质控品的成分应与检测患者样本的基质相似或一样。理想的基质是使用人血清、尿液或脑脊液等。

（二）标准品

标准品是含量确定的处于一定基质中特性明确的、被用于校正仪器或证实一种测定方法的物质。国际标准化委员会将其分为三级：①一级标准品（原级参考物）：是已经确定为稳定而均一的物质，它的数值由决定性方法测定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质已经定量，且有证书，可用于校正决定性方法、评价及校正参考方法以及为“二级标准品”定值；②二级标准品（次级标准品）：由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定，主要用于常规方法的标化或为控制物定值；③三级标准品：有冻干品或溶液，以参考方法用一级或二级标准品定值，用于质量控制，一般不用于标化。

（三）参考物质

参考物质是一类充分均匀，并具有一个或多个确定的特性值的材料或物质，用以校准测量系统、评价测量程序或为材料赋值。

1.参考物质的分类

参考物质具有校准和评价测量系统两个主要功能，因此参考物质又可分为校准物和正确度质控物。一种参考物质在一个测量程序或测量系统中既可以用作校准物，也可以用作正确度质控物，但不可以同时用作校准物和正确度质控物。

2.参考物质的分级

①一级参考物质：是具有最高计量学特性的参考物质，是测量单位的体现体，具有最小测量不确定度。它可由一级参考测量程序直接定值，也可通过可靠的杂质分析简介定值。一级参考物质一般是高度纯化的分析物，用于校准二级参考测量程序。②二级参考物质：由一种或多种二级参考测量程序定值，一般具有与实际样品相同或相似的基质，主要用于量值传递。一级参考物质主要在参考实验室中使用，而二级参考物质在临床检验溯源性的建立中发挥重要作用。

五、试剂盒

（一）试剂盒的分类

1.按性状分类

分为干粉试剂、液体试剂和浓缩试剂。①干粉试剂：将各组分溶于液体中分装再冻干，或混合后打成片剂，使用前加入指定量的缓冲液使其溶解（即复溶）；②液体试剂：具有组分均一、瓶间差和批间差较小、操作误差小等优势，无需复溶，但许多酶类试剂盒易受温度的影响；③浓缩试剂：使用时只需取很少的量，再加入重蒸馏水稀释配制成工作液即可，试剂不易蒸发及降解，稳定性更好，便于工作、储存、运输和装载。

2.按组成分类

分为单试剂和双试剂。①单试剂：将检验项目所用到的试剂混合组成为一种试剂，使用时只需将标本和试剂按一定比例混合即可进行相应的检测；②双试剂：将检验项目所用到的试剂分成两类，分别配制成两种试剂，通常试剂加入后可起到全部或部分消除某些内源性干扰的作用，试剂二启动检测物质的反应。

（二）试剂盒的要求

1.试剂盒应具有完整的包装和详尽的说明书。外包装应完整牢固，并清晰印有产品名称、生产批号、失效日期、保存条件及生产单位名称等信息。说明书应按照《体外诊断试剂说明书编写指导原则》格式要求进行编写，应包含反应原理、操作程序、标本的要求、标准/质控的使用方式及货号、试剂的稳定性以及灵敏度、抗干扰性和线性范围等技术指标。

2.具有水溶性、低黏度、无毒害、无腐蚀、不易燃易爆、无环境危害性。

3.除少数干粉或冻干生化试剂溶解较慢外，一般粉末状试剂加入溶剂后应在5min内溶解完全，如溶解速度慢常表示试剂质量欠佳。生化粉末状试剂应均匀无凝块、不黏附于瓶壁，若出现凝块或黏附于瓶壁表示试剂受潮。生化液体酶试剂或其他液体试剂应无沉淀、无混浊，若出现沉淀或混浊亦说明试剂变质或被污染。

4.试剂盒成分应该在包装规定的保存有效期内稳定，一般要求复溶后生化酶试剂室温稳定应在8~24h或以上。

5.有国家标准品、参考品的产品，应当使用国家标准品、参考品对试剂盒的性能进行检验，并符合相关要求。

（三）试剂盒性能评价

试剂盒的性能评价主要从实用性和可靠性两个方面评估，实用性包括标本类型、操作要求、消耗品要求、技术职能要求、成本等因素，对其可靠性的评估应从以下几个方面展开：

1.准确度

通常以回收率、对比试验及干扰试验的结果来分析判断。做回收试验时，回收值不得超出线性范围，回收率一般要求在（100%±5%）以内。对于一些无法准确加入的待测物（如酶和一些难以得到的标准待测物）也可以用对比试验。

2.精密度

试剂的瓶间差异、批内精密度和批间差异三组测定的平均值之间应无明显差异，否则，试剂盒的均一性则不符合要求。批间精密度往往与试剂盒的稳定性和试剂的均匀性有关，但也与标本的均匀性有关，在判断结果时应注意排除标本非均匀性的影响。

3.线性范围

指该试剂盒按其说明使用时可准确测量的范围。一般试剂盒的线性范围要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。一旦线性范围变窄，该试剂盒应废弃。

4.稳定性

稳定性是指试剂盒在规定条件下储存仍保持其性能指标的期限，包括原包装试剂的稳定性、复溶后试剂的稳定性和不同温度下的保存期。试剂盒的稳定性与储存条件密切相关，工作液的稳定性还和使用中的污染与否有关，在评估时须保持指定条件储存并要严防污染。

应当对多批产品进行性能评估，对结果进行统计分析，以有效地控制产品生产工艺及产品质量的稳定。

六、常用量器

（一）常用量器种类

量器是指对液体体积进行计量的器皿，如吸量管、容量瓶、量筒、刻度吸量管、刻度离心管及自动加液管等。

1.容量瓶

用于配制一定浓度标准溶液或试样溶液。颈上刻有标线，表示在20℃，溶液装至标线的容积，有50mL、100mL、200mL、250mL、500mL、1 000mL等几种规格，并有白色、棕色两种颜色。使用量瓶配制溶液时，一般是先将固（液）体物质在洁净小烧杯中用少量溶剂溶解，然后将溶液沿玻棒转移到量瓶中。当稀释至液面接近标线时，再小心逐滴加入溶剂至液面的弯月面最低点恰好与标线相切。将量瓶反复倒转摇动，至溶液充分混匀即可。

2.量筒

量筒是用来量取要求不太严格的溶液体积的。其容量允许误差大致与其最小分度值相当。在配制要求不太准确的溶液浓度时，使用量筒比较方便。它有从5~2 000mL十余种规格。用量筒量取液体体积是一种粗略的计量法，所以，在使用中必须选用合适规格，不要用大量筒计量小体积，也不要用小量筒多次量取大体积的溶液。读取刻度的方法与容量瓶和滴定管相同。用量筒或量杯量取溶液体积时，试剂瓶靠在量筒口上，试剂沿筒壁缓缓倒入至所需刻度后，逐渐竖起瓶子，以免液滴沿瓶子外壁流下，反之从量筒或量杯中倒出液体时亦如上操作。

3.吸量管

可准确地量取溶液的体积。使用前先根据需要选择适当的吸量管，刻度吸量管的总容量最好等于或稍大于最大取液量。用拇指和中指（辅以无名指），持吸量管上部，用示指堵住上口并控制液体流速，用橡皮球将液体吸至最高刻度上端l~2cm处，然后迅速用示指按紧管上口，将吸量管提出液面，然后用示指控制液体缓慢下降至所需刻度（此时液体凹面，视线和刻度应在同一水面上），并立即按紧吸量管上口。放液时，管尖最好接触容器内壁。但不要插入容器内原有的液体中，以免污染吸量管和试剂。吸量管使用后要及时用自来水冲洗干净。

4.微量加液器

微量加液器又称微量移液器，分固定式和可调式两种类型，固定式指一支加液器只能移取一种规定容量的液体，因其可变因素少，常用于标准液和标本的移取；可调式加液器，指一支加液器移取的体积可根据需要调整，即可一器多用。因微量加液器使用方便，体积较准确，现已广泛应用于临床生物化学检验实验室。微量加液器的规格在l~10µl之间不等，可根据不同的需要选用。现已有1~5mL规格的加液器，可取代玻璃吸管，以提高准确度。

（1）原理：

当按压加液器手柄时，加液器内活塞在活塞腔内做定程运动，排出活塞腔内一定体积空气，松开按压力后，利用活塞在弹簧压缩力作用下复位时产生的负压，吸入一定量体积的液体。

（2）使用方法：

将塑料吸液嘴套在加液器的下端，轻轻旋动，以保证密封，如为可调式加液器，应将其调节到所需吸取体积标示处。在正式吸液前，应将加液器吸排空气几次，以保证活塞腔内外气压一致。将加液器手柄按压到第一停止点，并把吸液嘴浸入液面下2~3mm，再缓慢地松开压力，使之复位，待1~2s后，取出加液器，将加液器移至容器底部，缓慢按压手柄至第一停点，待1~2s后；再将手柄按压至第二停点，以排尽吸液嘴内全部液体，取出加液器，放松手柄，使之复位，此即为一次操作全过程。

（二）量器的读数

读数时，应背对光线，量器垂直于地面，视线与凹液面下缘相切。

（三）量器的校正

实验室内的量器应定期进行校正。以上述玻璃量器为例，其校正均通过称量量器装入或流出水的重量W，再根据该温度下水的密度d，计算出量器的容积V，V=W/d（mL）。V与玻璃量器的标示容积比较，其误差应小于规定允许误差。

（四）量器的洗涤

实验中所使用器皿应保持洁净，其内外壁应能被水均匀地湿润，且不挂水珠。烧杯、量筒、量杯等一般玻璃器皿，可用毛刷蘸去污粉或合成洗涤剂刷洗，再用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水或去离子水润洗三次。滴定管、移液管、吸量管、容量瓶等具有精确刻度的仪器，可采用合成洗涤剂洗涤，后弃去，用自来水冲洗干净后，再用蒸馏水或去离子水润洗三次。如果未洗干净，可用铬酸洗液进行洗涤。

七、采血管

目前，临床上普遍使用真空采血技术对血液标本进行采集。真空采血系统由无菌真空采血管、标准双向采血针头及配套持针器三部分组成。其中真空采血管由管子、橡胶塞子、盖子、标签及添加剂等组成，主要用于血液标本的采集与保存。标准真空采血管头盖和标签的不同颜色代表不同的添加剂种类和试验用途，这样可根据要求选择相应的试管。

（一）添加剂

临床上常用的血液标本添加剂及作用原理如下：

1.乙二胺四乙酸（EDTA）

EDTA及其盐可以有效地螯合血液标本中的钙离子，阻滞和终止内源性或外源性凝血过程，从而防止血液标本凝固。

2.枸橼酸钠

又称柠檬酸钠，能与钙离子形成螯合物，从而阻止血液凝固。

3.肝素

肝素能够与抗凝血酶Ⅲ结合，使抗凝血酶Ⅲ的构型发生改变，活性部位充分暴露，从而更好地跟凝血因子相结合，抑制凝血因子。此外，肝素还能够抑制血小板的聚集。

4.草酸钾/氟化钠

氟化钠是一种弱抗凝剂，一般同草酸钾或乙碘酸钠合并使用，其混合物可抑制血糖分解且使血液在一定时间内不凝固，是血糖测定常用的抗凝剂，但不能用于尿素酶法测定尿素，也不用于测定碱性磷酸酶和淀粉酶。

（二）用途

临床上常用的真空采血管及其主要检验项目见表2-2。

（三）使用采血管的注意事项

1.同时采集多项血液标本时，应先注入培养瓶，其次是无添加剂的普通试管，再注入含固体抗凝剂的试管，最后注入含液体抗凝剂的试管。使用蝶翼针采血时，先接需氧瓶是为了将连接管中的空气引入需氧瓶。而使用注射器采血时，由于空气在注射器中上飘，应先接厌氧瓶。推荐采血顺序见图2-1。

2.采血时若用错试管，切不可将血液倒入所需试管。

3.血液与抗凝剂的比例要精确。血液比例高时，由于抗凝剂相对不足，血液中出现微凝块的可能性增加。血液比例低时，由于抗凝剂相对量多，可影响检验结果。抗凝剂在血标本中的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度进而影响实验结果。

4.采血管内有异物或沉淀物存在，请不要使用。

（王　敏）