第五节 离心技术

离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在做匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物，在生物化学以及其他的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。

一、离心技术原理

（一）离心力

离心作用是根据在一定角速度下做圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（centrifugal force，F_C）的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：

F_C=mω2X

其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。

（二）相对离心力

由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力会发生变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。

相对离心力（relative centrifugal force，RCF）就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/s2）；n为转子每分钟的转数（rpm）。

在上式的基础上，Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图，将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在离心力的转换列线图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。例已知离心机转数为2 500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500×g即是RCF值。

（三）沉降系数

根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义：沉降系数（sedimentation coefficient，S）是指颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。

积分得

若ω用2πn/60表示，则

式中X₁为离心前粒子离旋转轴的距离；X₂为离心后粒子离旋转轴的距离。S实际上时常在10-13s左右，故把沉降系数10-13s称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。

（四）沉降速度

沉降速度（sedimentation velocity）是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。

式中r为球形粒子半径；d为球形粒子直径；η为流体介质的黏度；ρ_P为粒子的密度；ρ_m为介质的密度。

从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加，将此式代入上述沉降系数公式中，则S的表示式也可表示为：

从该式中可看出，①当ρ_P > ρ_m，则S > 0，粒子顺着离心方向沉降；②当ρ_P=ρ_m，则S=0，粒子到达某一位置后达到平衡；③当ρ_P < ρ_m，则S < 0，粒子逆着离心方向上浮。

（五）沉降时间

在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需解决沉降时间（sedimentation time，Ts）来确定分离某粒子所需的时间。

根据沉降系数（S）式可得：

将左侧r点与右侧n点连成一条直线，与中间RCF相交的点即为相对离心力（×g）RCF=1.118×102×r×n2。

积分得

式中X₂为离心转轴中心至离心管底内壁的距离；X₁为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离，那么样品粒子完全沉降到底管内壁的时间（t₂-t₁）用T_s表示则式可改为：

式中T_s以小时为单位，S以Svedberg为单位。

（六）K系数

K系数（K factor）是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。也就是溶液恢复澄清程度的一个指数，所以也叫“cleaning factor”。原则上，K系数愈小的，愈容易，也愈快将粒子沉降。

其中R_max为转子最大半径；R_min为转子最小半径。由其公式可知，K系数与离心转速及粒子沉降的路径有关。所以K系数是一个变数。当转速或者离心管的溶液量不同，即粒子沉降的路径改变时，K系数就改变了。通常，离心机的转子说明书中提供的K系数，都是根据最大路径及在最大转速下所计算出来的数值。如果已知粒子的沉降系数为80S的多聚体，采用的转子的K系数是323，那么预计沉降到管底所需的离心时间是T=K/S=4h，利用此公式预估的离心时间，对水平式转子最适合；对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间来得快些。

二、离心的基本方法

离心方式多样，目前使用得比较多的有沉淀离心、差速离心、密度梯度离心、分析型超速离心等。

（一）沉淀离心

沉淀离心技术是目前应用最广的一种离心方法。一般是指介质密度约1g/mL，选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心力的作用下完全沉淀下来的方法。沉降速度与离心力和颗粒大小有关。

（二）差速离心法

差速离心法利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀的方法。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。主要是利用颗粒的大小、密度和形状差异进行分离。

（三）密度梯度离心

凡使用密度梯度介质离心的方法均称为密度梯度离心，或称区带离心。密度梯度离心主要有两种类型，即速度区带离心和等密度区带离心。

1.速率区带离心法（rate-zonecentrifugation）

根据大小不同、形状不同的颗粒在梯度液中沉降速度不同建立起来的分离方法。在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、CsCl等），待分离的样品位于梯度液的上面，同梯度液一起离心。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。

由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。

2.等密度区带离心法（isopycnic zone centrifugation）

根据颗粒密度的差异进行分离的方法。离心时，选择相应的密度介质和使用合适的密度范围是非常重要的。在等密度介质中的密度范围正好包括所有待分离颗粒的密度。样品可以加在密度梯度介质的上面，也可以与密度介质混合在一起，待离心后形成自成型的梯度。颗粒在这两种梯度介质中，经过离心，最终都停留在与其浮力密度相等的区域中，形成一个区带。等密度区带离心法只与样品颗粒的密度有关，而与颗粒的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，延长离心时间也不能改变这些颗粒的成带位置。

此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。

（四）分析性超速离心

与制备性超速离心不同，分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组分。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴连接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳两个小室：分析室和配衡室。配衡室是一个经过精密加工的金属块，作为分析室的平衡用。分析室的容量一般为1mL，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普遍水平转子相同。分析室有上下两个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收（如对蛋白质和DNA）或折谢率的不同对沉降物进行监视。

分析性超速离心一般应用于测定生物大分子的相对分子重量、研究生物大分子的纯度和分析生物大分子中的构象变化。

（徐克前）