第四节　细胞（组织）化学和免疫化学染色技术

细胞化学（cytochemistry）是细胞学与生物化学相结合的一门学科分支。细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察。细胞免疫化学（immunocytochemistry）染色，是鉴定某些病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病细胞的辅助性技术。细胞化学和细胞免疫化学（染色）用组织标本进行时，通常称为组织化学或免疫组织化学（染色）。

一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术

（一）细胞化学染色

1.铁染色

正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。

（1）原理：

骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。

（2）试剂：

铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。

（3）操作：

取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。

（4）结果判定

1）细胞外铁：

细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在于巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。

2）铁粒幼细胞：

为中幼红细胞和晚幼红细胞胞质内出现蓝色细小颗粒。

3）铁粒红细胞：

为红细胞内出现蓝色细小颗粒。

4）环铁粒幼红细胞：

幼红细胞胞质中含有铁粒 ≥ 6 粒，围绕核周排列成1/3 圈以上者。

5）病理性铁粒幼细胞：

幼红细胞胞质中含有铁粒 ≥ 6粒，不见明显的环核周排列。

6）铁粒幼细胞分型：

Ⅰ型为铁粒幼细胞含有1～2颗铁粒；Ⅱ型为铁粒幼细胞含有3～5颗；Ⅲ型为铁粒幼细胞含有6～10颗；Ⅳ型为铁粒幼细胞含有铁粒10颗以上。

（5）方法学评价：

铁染色是贫血骨髓细胞形态学检验的必需项目，是评判体内铁缺乏的“金标准”，也是评估细胞铁利用障碍的最佳方法。通过铁染色检验可以发现早期IDA和无贫血的隐性缺铁，明确是缺铁性、非缺铁性还是铁利用障碍性、铁代谢反常性贫血。

铁染色操作中，需要排除一些干扰因素：涂片标本不能污染铁质；铁染色液配制，组成的亚铁氰化钾溶液和盐酸的比例取决于后者的实际浓度，当久用的浓盐酸浓度下降时，需要适当增加浓盐酸溶液的量，两者的最适比例是盐酸稍过量，而后用亚铁氰化钾溶液缓慢回滴至盐酸过量产生的雾状瞬间澄清为最佳；新鲜配制的亚铁氰化钾溶液为淡黄色，放置后亚铁被氧化成三价铁离子而变成绿色时，不宜使用；染色时间宜长，尤其当室温低时更需要延长染色时间；陈旧骨髓涂片染色或染色后放置数日观察都可造成细胞外铁假阳性或阳性强度增加。

通常，骨髓小粒间都有一致的铁染色反应，若仅孤立出现一个骨髓小粒明显的阳性反应，而其他无反应则多为假性，需要重新检验；观察细胞内铁粒，需轻巧缓慢调节显微镜，若铁粒与胞质明显不在一个焦点上大多不是铁粒。

（6）质量保证：

铁染色的质量保证主要有以下五个方面，其中第一至第四条尤其重要。一是试剂质量的保证（前述）；二是注意实验室室温与染色时间的关系（前述），延长染色时间是保证标本中的铁含量充分显示（不增加不良反应）；三是掌握复染液的浓度、复染时间长短对涂片背景清晰度的影响；四是显微镜的质量和镜检技巧的把握（前述）；五是标本制备和试剂配制中，避免铁物质的接触。

（7）正常参考值：

细胞外铁染色为阳性（+～++），细胞内铁阳性率为25%～90%（上限有不同见解），铁粒 ≤ 5颗，不见Ⅲ型和Ⅳ型铁粒幼细胞。

（8）临床意义

1）协助诊断缺铁性贫血：

骨髓涂片细胞外铁消失，铁粒幼细胞百分率下降。铁粒幼细胞以Ⅰ型为主，甚至铁粒幼细胞消失。经铁剂治疗后细胞外铁增多。因此，骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。

2）协助诊断铁利用障碍性贫血：

细胞外铁增加（部分正常），细胞内铁异常，Ⅲ型、Ⅳ型增多，可见较多的环形铁粒幼红细胞。这类贫血有SA（环形铁粒幼红细胞 ＞ 5%或 ＞ 15%）、AA、MA、MDS、红血病等。

3）协助诊断铁代谢反常性慢性贫血：

细胞外铁增加（也可正常）而细胞内铁减少者为铁代谢反常。见于较多的慢性感染性贫血、中晚期癌症所致的贫血、结缔组织病性贫血、慢性肾病性贫血等。

4）反映机体内铁的贮存和利用情况：

细胞外铁减少或消失表示骨髓贮存铁已将用完。若患者为小细胞性贫血，而骨髓细胞内、外铁正常至增多，则提示有铁利用障碍。

2.中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色（偶氮偶联法）

（1）原理：

NAP在pH 9.5条件下能水解磷酸萘酚钠，释放出萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于酶活性处。

（2）试剂：

10%甲醛-甲醇固定液（甲醛10ml、甲醇90ml，混合后置4℃冰箱）；0.05mol/L缓冲液（二氨基二甲基-1，3 丙二醇2.625g，蒸馏水500ml，溶解混合后置4℃冰箱）；基质液（α-磷酸萘酚35mg溶于0.05mol/L缓冲液35ml），而后加入重氮盐坚固蓝B 35mg溶解；复染液（1%苏木精溶液）。

（3）操作：

将新鲜涂片浸于4℃固定液中30秒，水洗后晾干；入基质液中温育30分钟，水洗5分钟后晾干；复染液复染2分钟，水洗后，晾干镜检。

（4）结果判定：

中性粒细胞胞质内出现灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀为阳性反应。“-”为胞质内无阳性产物（0分）；“+”为胞质内显现灰褐色阳性产物（1分）；“++”为胞质内显现灰黑色至棕黑色沉淀（2分）；“+++”为胞质内基本充满至棕黑色至黑色颗粒状沉淀色（3分）；“++++”为胞质内全为深黑色阳性沉淀产物，甚至遮盖胞核（4分）。

（5）方法学评价：

血细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）主要存在于成熟中性粒细胞中，故习惯上称为中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP），也泛称为白细胞碱性磷酸酶（leukocytic alkaline phosphatase，LAP）。NAP由许多同工酶组成，在碱性条件下（最适pH为9.3～9.6）能催化各种醇和酚的单磷酸酯。显示NAP的古老方法是Gomori钙钴法，但其最大欠缺是温育染色时间过长，李氏设计改良的快速染色法则改正了钙钴法的不足。也有认为钙钴法灵敏度比偶氮偶联法低，故近年来逐渐被Kaplow偶氮偶联法所替代，但其显示阳性色泽则因重氮盐的种类而不同，基质液配制后即刻使用。

（6）质量保证：

标本需新鲜、规范固定，若固定时间延长将影响NAP活性。注意复染浓度和复染时间的把握，若复染太浅影响细胞观察。注意涂片厚薄对结果的影响，通常涂片薄阳性细胞及其积分低于涂片厚的区域。必须了解生理变化对NAP活性的影响，如应激状态、月经期和新生儿时期NAP积分可增高，老年人则可减低。染色中，需有阳性标本对照，若无阳性质控对照涂片时，可选择骨髓网状细胞、网状纤维及骨髓小粒内支架成分作为监控对象，若这些细胞或反应物呈阴性反应或阳性反应强度明显减弱时，可考虑失控现象，也可在整批染色（10份标本以上）时，分析染色后的整体结果积分是否全高或均低，若有此现象应考虑偏倚结果。

（7）正常参考值：

NAP阳性率为30%～70%，阳性细胞积分为35～100分，各实验室应建立自己的参考值。积分为各阳性细胞分值百分比的乘积之和。

（8）临床意义

1）鉴别CML与类白血病反应：

CML时NAP阳性率降低，积分降低，而类白血病反应往往阳性率增高，积分增高。

2）鉴别间变性大细胞淋巴瘤骨髓浸润与反应性组织细胞增多症：

间变性大细胞淋巴瘤（尤其是T细胞性）NAP活性降低，反应性组织细胞增多症一般增高。

3）鉴别AA与PNH：

AA时NAP活性常增高，阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）时NAP活性不增高。

4）鉴别细菌感染与病毒感染：

细菌感染时NAP活性明显增高，病毒感染时不增高或轻度增高。

5）鉴别白血病类型：

ALL、慢性淋巴系细胞白血病以及淋巴瘤患者的NAP活性常增加，而AML的各个亚型均不增高，除非合并感染时。

6）辅助PV和ET诊断：

PV和ET时NAP活性明显增高，而继发性者一般不增高或仅轻度增高。慢性中性粒细胞白血病（MPN），NAP活性显著升高；PMF时NAP活性增高。

7）其他：

CML慢性期NAP积分降低，甚至酶活性消失，化疗缓解时则回升，急变时增高。此外，NAP染色可用来显示骨髓中呈阳性反应的网状细胞或巨噬细胞，可以评估骨髓造血旺盛的程度。

3.过氧化物酶（POX）染色（ICSH推荐法）

（1）原理：

粒系和单核系细胞含有的POX能将二氨基联苯胺的氢原子转移给过氧化氢，产生有色染料沉淀与胞质酶活性处。

（2）试剂：

具体如下：

甲醛-丙酮缓冲液（pH 6.6）：磷酸氢二钠20mg，磷酸二氢钾 100mg，蒸馏水 30ml，丙酮 45ml，400g/L 甲醛溶液 25ml（配制后4℃保存）；

50mmol/L Tris-Hcl缓冲液（pH 7.6）：基质液：3，3二氨基联苯胺20mg，Tris-Hcl缓冲液50ml，3%过氧化氢溶液0.2ml，振荡混合后过滤（临时配制）。

（3）操作：

新鲜涂片用冷甲醛-丙酮缓冲液固定30秒（4℃），流水冲洗；入基质液温育10～15分钟（20±5℃），流水冲洗；Giemsa染液复染30 分钟，流水冲洗，晾干，镜检。

（4）结果判定：

阳性产物为棕黄色颗粒。“-”为胞质中无阳性颗粒；“±”为胞质中细小阳性颗粒；“+”胞质中阳性颗粒较粗大，常呈局限性分布；“++”为阳性颗粒粗大密集，占胞质的1/2～2/3；“+++”为阳性颗粒粗大几乎布满胞质；“++++”阳性颗粒呈团块状，充满胞质，可覆盖核上。

（5）方法学评价：

POX染色方法有Washburn法、二氨基联苯胺法、四氨基联苯胺法和Pereira法等。Washburn法曾是最为常用的方法，但由于其底物联苯胺具有致癌性，应用渐少。ICSH（1985）推荐三种方法：二氨基联苯胺法（DAB法）、氨基-甲基卡巴唑法和二盐酸联苯胺法。二氨基联苯胺法是其中的常用方法。

染色中，同时选择前1～2天骨髓检查而无明显改变和无临床可疑血液病的标本作为质控对照，尤其要重视受检标本中非白血病细胞的反应特性，它是自身质量监控的重要手段，如残余的应该阳性反应的正常细胞（对照的背景细胞）出现阴性（除非白血病细胞阳性），或阴性的正常细胞出现阳性，首先应考虑技术原因或试剂因素造成的失控。在观察中，还需要重视显微镜的质量和镜检技巧的把握，尤其注意位于核旁的微弱阳性颗粒。

（6）质量保证：

试剂的质量（前述）对染色结果有明显影响，需引起极度重视。应设质控片对照，尤其应关心受检标本中非白血病细胞的反应特性，它是染色质量自身监控的重要手段，如残余的应该阳性反应的正常细胞（对照的背景细胞）出现阴性（除非白血病细胞阳性），或阴性的正常细胞出现阳性，首先应考虑技术原因或试剂因素造成的失控。需要重视显微镜的质量和镜检技巧的把握，尤其注意有时位于核旁的微弱阳性。

（7）正常细胞参考反应：

粒系和单核系细胞阳性，并随着细胞成熟而反应增强，故早期的原始粒细胞和原始单核细胞可出现阴性反应，尤其是原始单核细胞（甚至幼单核细胞）。嗜酸性粒细胞阳性，嗜碱性粒细胞阴性。

（8）临床意义：

POX染色主要用于急性白血病类型之间的鉴别诊断。通常阳性 ＞ 3%考虑为AML， ＜ 3%考虑为ALL，但AML的M0、M7阳性细胞也为 ＜ 3%，在M5a中亦易见阴性病例。在AML中，M3白血病细胞强阳性，AML的M2、M4阳性，M1弱阳性或阳性，M5弱阳性或阴性，M6（红血病细胞）阴性。成熟粒细胞或单核细胞POX阴性或活性降低为其酶活性缺乏，在髓系肿瘤中主要见于AML和MDS。

4.苏丹黑 B（SBB）染色

（1）原理：

SBB是一种脂溶性染料，可溶解细胞内的含脂结构，将中性脂肪、磷脂、胆固醇和糖脂等成分被着色为棕黑色至深黑色的颗粒，定位于胞质。

（2）试剂：

固定液（40%甲醛或10%甲醛生理盐水）；SBB贮存液（SBB 0.3g溶于100ml无水乙醇）；SBB缓冲液（酚16g溶于30ml无水乙醇，另取 12水分子磷酸氢二钠0.3g溶于100ml蒸馏水中，取两液等量混合）；SBB染色液（取贮存液60ml和SBB 缓冲液40ml混合）；复染液（Wright-Giemsa染液或1g/L沙黄溶液）。

（3）操作：

涂片40%甲醛蒸气固定或10%甲醛生理盐水中固定5～10分钟；流水冲洗，晾干后入SBB染色液温育1～2小时；取出快速流水冲洗后复染液；流水冲洗，晾干镜检。

（4）结果判定：

同POX。阳性反应的灵敏度通常高于POX，可见SBB阳性而POX阴性的同类细胞。

（5）方法学评价：

SBB染色时间应根据实际染色效果而定，一般情况下染色30分钟至2小时，但染色时间过长有时会影响涂片背景的清晰性。采用不同复染液，需达到阳性和阴性细胞结构和涂片背景清晰。为避免SBB染色后染料沉着或背景不清晰，在染色时将染液置小平皿内，两端放置小段玻璃棒，血膜向下进行架空染色。

（6）质量保证：

见方法学评价和POX。

（7）正常细胞参考反应：

与POX基本相同。

（8）临床意义：

与POX基本相同，但由于SBB阳性产物明显且阳性率较POX为高，故在AML-M5中常可见POX阴性而SBB阳性，因此，两者同时染色可以互补。通常AML-M5阳性产物细小和局限，AML-M1和M2阳性颗粒较为粗大，AML-M3白血病细胞几乎全呈强阳性反应。

5.乙酸萘酯酶（NAE）染色和氟化钠抑制试验

NAE是应用最多的一种非特异性酯酶。在其染色液中，加入适量的氟化钠后，对比观察其NAE活性被抑制的程度称为NAE酯酶抑制试验（sodium fluoride inhibited esterase test）。在染色液中加入氟化钠也适用于其他酯酶染色方法。

（1）原理：

造血细胞内的NAE在近中性条件下可水解底物 α-乙酸萘酯（α-naphthyl acetate，α-NA 或 NA），使底物释放α-萘酚，后者再与重氮盐偶联，生成不溶性有色沉淀定位于胞质。氟化钠抑制试验即在基质液中加入氟化钠后，单核系细胞即可出现明显的NAE活性被抑制。

（2）试剂：

固定液（10% 甲醛生理盐水溶液）；1% α-NA溶液（α-NA 1g溶于 50ml丙酮和 50ml蒸馏水）；0.05mol/L（pH 7.4）磷酸盐缓冲液和重氮盐（坚牢蓝RR或其他相应重氮盐，如坚牢蓝 B）；基质液［0.05mol/L（pH 7.4）磷酸盐缓冲液100ml，一边充分振荡一边缓慢滴入2ml α-NA溶液，最后加入重氮盐100mg，溶解后过滤，分为两份，一份加入氟化钠，终浓度为1.5g/L］。或者采用以下方法配制：α-NA 100mg溶解于50%丙酮水溶液后，加入0.05mol/L（pH 7.4）磷酸盐缓冲液100ml，最后加入重氮盐100mg，溶解。复染液（10g/L甲绿溶液或1g/L沙黄溶液）。

（3）操作：

新鲜涂片2张，10%甲醛生理盐水溶液固定5分钟，流水冲洗，晾干；1张置入基质液，另1张置入加入氟化钠的基质液，各温育作用37℃ 1小时；流水冲洗，复染液复染2分钟，流水冲洗。

（4）结果判定：

在基质液中以坚牢蓝RR为重氮盐，阳性反应为胞质内出现灰黑色至棕黑色弥散性或颗粒状沉积。“-”为胞质中无阳性颗粒；“±”为胞质中可见细少阳性颗粒；“+”胞质显现均匀浅色阳性反应，占胞质 ＜ 1/4；“++”为胞质显现均匀灰黑色阳性产物，占胞质 ＜ 1/2；“+++”为胞质充满棕黑色阳性产物；“++++”胞质充满致密黑色阳性产物呈团块状。

加入氟化钠后的阳性酯酶抑制率为未加氟化钠酯酶阳性率或积分减去加氟化钠酯酶阳性率或积分，除以加氟化钠酯酶阳性率或积分，再乘以100%。

（5）方法学评价：

NAE染色满意是否，关键之一是配制基质液的技巧，滴入α-NA溶液须缓慢地一滴一滴滴入又要小心防止滴入的试管触及母液或在振荡中母液沾污试管头。氟化钠抑制试验中，氟化钠浓度很重要，微量称取要准。

（6）质量保证：

NAE染色对试剂配制的要求高，应高度重视，若用商品试剂盒，在使用前应严格进行批间对照或质量评价。标本中自身细胞的阳性和阴性质控对照见POX染色。

（7）正常细胞参考反应：

单核细胞呈弥散性絮状阳性，被加入氟化钠后阳性酯酶被抑制；粒系细胞、巨核细胞和淋巴细胞多呈细小颗粒状阳性，不被加入氟化钠后抑制。

（8）临床意义：

主要用于辅助鉴别白血病类型，当白血病细胞NAE呈明显的阳性反应，且其阳性产物为氟化钠抑制时，应考虑为AML-M5，部分白血病细胞阳性并被氟化钠抑制时应考虑为AML-M4，白血病细胞阴性或（弱）阳性，且其阳性产物不被氟化钠抑制者则考虑其他类型白血病，如AML-M1和M2、ALL和AML-M7。APL细胞为早幼粒细胞（样）细胞，有特殊性，NAE常呈明显的阳性反应，其阳性产物也可被氟化钠抑制。

6.氯乙酸ASD萘酚酯酶（CE）染色

（1）原理：

粒细胞内的CE能水解基质中的氯乙酸ASD萘酚产生ASD萘酚，后者与重氮盐偶联生成不溶性红色沉淀，定位于胞质酶活性处。

（2）试剂：

固定液（10%甲醛甲醇溶液，4℃保存）；六偶氮对品红溶液［取4%对品红溶液（4g对品红溶于2mol/L盐酸100ml）和4%亚硝酸钠水溶液（临时配制）各0.125ml等量混合1分钟］；底物溶液（取底物氯乙酸ASD萘酚5mg，溶于2.5ml N，N 二甲基甲酰胺溶剂）；0.067mol/L（pH 6.7）磷酸盐缓冲液；基质液（先将临时配制的2.5ml底物溶液加到47.5ml磷酸盐缓冲液中，而后加入临时配制的0.25ml六偶氮对品红溶液）；复染液（10g/L甲基绿溶液）。

（3）操作：

将涂片入固定液固定30秒，或蒸汽固定5分钟，流水冲洗，晾干；入基质液于染色湿盒37℃温育1小时，流水冲洗；入复染液5分钟，流水冲洗，晾干镜检。

（4）结果判定：

阳性产物为红色颗粒或弥散性沉淀，定位于胞质酶活性处。根据阳性产物强弱，参考NAE阳性产物分级标准进行分级。

（5）质量保证：

标本新鲜和对品红溶液新鲜配制是染色结果良好的前提。用商品试剂盒，在使用前应严格进行批间对照或质量评价。标本中自身细胞的阳性和阴性质控对照见POX染色。

（6）正常细胞参考反应：

粒系细胞阳性。原粒细胞中多呈不同程度的阳性反应，早期原始粒细胞可呈阴性反应，早幼粒细胞至成熟中性粒细胞全呈阳性反应，但酶活性不随细胞的成熟而增强。与中性粒细胞相比较，嗜酸性粒细胞的酶活性较弱。单核系细胞、淋巴系细胞、幼红细胞和血小板均为阴性。

（7）临床意义：

CE为粒细胞特异性酯酶，故又称粒细胞酯酶，与POX、SBB一起共同构成粒细胞阳性反应的细胞化学特征，是鉴别ALL与AML，以及AML-M4与M5重要的辅助指标。AML-M1和M2原始细胞呈阳性反应，阳性常在30%以上，AML-M3异常早幼粒细胞呈强阳性，AML-M5和ALL阴性，AML-M4粒系白血病细胞阳性，单核系白血病细胞阴性。CE也是肥大细胞的特异酯酶，有助于肥大细胞疾病的诊断和鉴别诊断。CE染色可以帮助鉴别嗜碱性粒细胞与肥大细胞，前者CE阳性或阴性，后者强阳性。

7.丁酸萘酯酶（NBE）染色

（1）原理：

血细胞内的NBE在碱性条件下，将基质液中的α-丁酸萘酯水解，释出α-萘酚，再与六偶氮对品红偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于胞质酶活性处。NBE主要位于单核系细胞，可被氟化钠抑制，宜同时做氟化钠抑制试验。

（2）试剂：

固定液（甲醛）；基质液［0.1mol/L（pH 8.0）磷酸盐缓冲液95ml，加入溶于5ml乙二醇-甲醚的α-丁酸萘酚100mg的底物溶液，而后加入六偶氮对品红溶液0.5ml（配制同CE），混合液充分混匀，过滤后均分于两个染色缸（各50ml）中，其中一缸加氟化钠75mg］；复染液（10g/L甲基绿溶液）。

（3）操作：

涂片甲醛蒸汽固定5分钟，水冲洗，晾干；入染色基质液，37℃温育45分钟，流水冲洗；入10g/L甲绿复染液复染10分钟，水洗；晾干镜检。

（4）结果判定：

阳性产物为定位于胞质的不溶性棕红色或棕红色沉淀。

（5）方法学评价：

NBE属于碱性非特异性酯酶，阳性产物色泽视重氮盐而不同，若用坚牢蓝BB盐为蓝色。染色基质液含酯量高，37℃水浴后要连缸冲洗3分钟左右，保持涂片背景干净。

（6）质量保证：

涂片标本新鲜和基质液配制即时应用，是染色结果良好的前提。用商品试剂盒，在使用前应严格进行批间对照或质量评价。标本中自身细胞的阳性和阴性质控对照见POX染色，或者选一张成熟单核细胞较多的涂片作为对照。

（7）正常细胞参考反应：

单核系细胞中，幼单核细胞和单核细胞阳性，原始单核细胞多为阳性，巨噬细胞阳性。单核系细胞阳性反应可被氟化钠抑制。粒系细胞阴性，可见细小点状阳性。外周T细胞可呈致密的局限性点状阳性、B淋巴细胞为阴性。

（8）临床意义：

NBE存在于单核系细胞中，常呈弥散性阳性反应，是临床血液学鉴定AML-M5、AML-M4和慢性粒单细胞白血病（CMML）单核细胞增多的有效指标，还可用于体外造血细胞培养中单核巨噬细胞集落的识别（巨噬细胞和组织细胞阳性）。AML-M5阳性，M4单核系细胞阳性（图4-135），其阳性反应被氟化钠抑制。AML-M1、M2和M3常为阴性，但可见点状阳性反应，并不被氟化钠抑制。慢性单核细胞白血病NBE阳性。

8.甲苯胺蓝染色

（1）原理：

甲苯胺蓝（toluidine blue）具有强异染色性，在酸性黏多糖存在时，特别是含硫酸性黏液物质存在时，颜色从蓝色变为红色。

（2）试剂：

甲苯胺蓝染液（100mg甲苯胺蓝溶于70%乙醇50ml）。

（3）染色：

涂片标本用甲醇固定5分钟，甲苯胺蓝染液染色10～20分钟，水洗，晾干后镜检。

（4）结果判定：

阳性产物为胞质中出现紫色、红色或粉红色沉淀，不同的色泽反应与异染性物质的类型有关，如γ型常显示红色或粉红色，β型常显示紫色。

（5）方法学评价：

甲苯胺蓝是一种阳离子染料，在一定条件下染酸性糖共轭物时，染色结果与染料固有的染色不同，如原呈蓝色的染料染色结果变成了紫红色，这种现象称为异染性（metachromasia）。这些染料染其他组织或细胞时，染色结果不会改变，称为正染性（orthochromasia）。异染性染料有多种，最常用的是甲苯胺蓝，是用于显示嗜碱性粒细胞和肥大细胞（图4-136）的较佳试剂，其染色的阳性细胞百分比显著高于WG染色。故在AML中，经甲苯胺蓝染色可常见嗜碱性粒细胞增多，在M3中也可见明显阳性的异常早幼粒细胞及后期阶段的阳性粒细胞（与嗜碱性粒细胞白血病的关系尚不明了）。涂片可不经固定，直接染色。

（6）质量保证：

我们认为，配制甲苯胺蓝染液的溶剂和溶剂的溶度不同，对嗜碱性粒细胞和肥大细胞的反应性有明显的影响，溶剂乙醇浓度以70%为佳。

（7）正常细胞参考反应：

阳性反应见于嗜碱性粒细胞和肥大细胞，其他造血细胞阴性。

（8）临床意义：

主要用于鉴定嗜碱性粒细胞白血病（包括CML嗜碱性急变）和肥大细胞白血病，以及相似造血系疾病的鉴别诊断（如早幼粒细胞白血病与嗜碱性粒细胞白血病）。也可辅助诊断伴嗜碱性粒细胞和肥大细胞增多的造血肿瘤，经甲苯胺蓝染色后，在光镜下难以辨别的小如淋巴细胞的嗜碱性粒细胞均可清晰显示。

9.酸性磷酸酶（ACP）染色

（1）原理：

血细胞内的ACP在酸性环境下，能水解基质液中的底物磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与重氮盐偶联，形成红色沉淀，定位于胞质酶活性处。当基质液中存在酒石酸时，多毛细胞的ACP（同工酶ACP5）表现出抵抗性，即为抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP），而其他细胞ACP（不同的ACP同工酶）的活性则被抑制，不再现阳性反应。

（2）试剂：

柠檬酸甲醇丙酮固定液（柠檬酸0.63g，蒸馏水30ml，甲醇 10ml，丙酮 60ml，调整 pH 5.4，4℃保存）；醋酸钠巴比妥钠缓冲液［a液：无水醋酸钠0.58g，巴比妥钠1.47g，蒸馏水冲 140ml；b 液：盐酸 0.85ml，蒸馏水 91.5ml。取 a 液 140ml，b 液 60ml，混匀，调整 pH 至 6.0］；L（+）酒石酸 150mg；基质液［磷酸萘酚AS-BI 20mg溶于N-N二甲基甲酰胺1ml，加入醋酸-巴比妥钠缓冲液10ml，加入蒸馏水28ml，最后加入六偶氮对品红液3ml，混合后用NaOH溶液调整pH至5.2～5.4，分为等量2份，1份溶入L（+）酒石酸150mg］；复染液（10g/L苏木精溶液）。

（3）操作：

涂片2张用固定液固定1分钟，蒸馏水冲洗2分钟；分别浸入加与未加酒石酸的基质液中，或滴加基质液，置湿盒内37℃作用45分钟，蒸馏水冲洗2分钟；苏木精复染液复染2分钟，流水冲洗。晾干镜检。

（4）结果判定：

胞质中出现红色颗粒者为阳性。

（5）方法学评价：

ACP染色法也可用Gomori硫化铅法，主要不足是孵育时间长。磷酸萘酚AS-BI为底物的偶氮偶联法由国际血液学标准化委员会推荐，但磷酸萘酚AS-BI试剂质量要求高。

（6）质量保证：

涂片新鲜和试剂配制正确是质量保证的关键，自身标本中阳性细胞（如单核细胞）和阴性细胞（幼红细胞）的存在是染色满意的反应。

（7）正常细胞参考反应：

几乎所有的血细胞都含有ACP，并为酒石酸所抑制。淋巴细胞（T和B）、粒细胞、血小板和幼稚红细胞呈弱至中等阳性反应。巨核细胞、浆细胞、单核细胞、巨噬细胞、组织细胞呈较强的阳性反应。破骨细胞呈强阳性，不被酒石酸抑制。

（8）临床意义：

主要用于辅助鉴定HCL的异常细胞，多毛细胞ACP阳性并不被酒石酸抑制，其他血液肿瘤细胞ACP阳性均可为酒石酸所抑制。其次用于鉴别Gaucher细胞和Niemann-Pick细胞，前者ACP阳性，后者阴性。骨髓瘤细胞、不典型淋巴细胞可阳性。

AML的ACP阳性反应一般明显于ALL。AML中，M3和M5常呈明显的阳性，反应产物弥散型分布，而ALL阳性产物常呈局灶型分布。慢性T系淋巴细胞白血病（如成人T细胞白血病/淋巴瘤、大颗粒淋巴细胞白血病）也可呈阳性反应，B淋巴细胞白血病为阴性或弱阳性反应。

10.过碘酸Schiff染色

（1）原理：

细胞内的糖类可用过碘酸希夫染色（periodic acid Schiff staining，PAS）显示，含有乙二醇基的糖类在过碘酸氧化作用下产生双醛基，后者与Schiff 试剂作用，使无色品红变为紫红色染料沉积，定位于含有多糖成分的部位。在过碘酸氧化前，用麦芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶处理标本，再作PAS染色，可鉴别是糖原还是其他多糖类物质，如被消化是糖原。

（2）试剂：

固定液（95%乙醇）；10g/L过碘酸溶液；希夫试剂（碱性品红1g溶于200ml煮沸的蒸馏水，冷却至60℃时加入1mol/L盐酸40ml，冷却至25℃时置于棕色瓶内再加入偏重亚硫酸钠2g，避光过夜，加入1g活性炭，吸附过滤后为无色透明液体，保存于4℃冰箱）；复染液（20g/L甲基绿溶液）。

（3）操作：

涂片入固定液固定10分钟，流水冲洗，晾干；浸入过碘酸溶液氧化10分钟，流水冲洗，晾干；置于Schiff 试剂作用1小时，流水冲洗；复染液复染10分钟，流水冲洗，晾干后镜检。

（4）结果判定：

胞质中出现红色或紫红色颗粒沉积或弥散者为阳性。

（5）方法学评价：

PAS可显示血细胞多糖类的含量，其中糖原是主要成分，故俗称糖原染色。血细胞糖原成分可反映细胞活力，借此区别某些细胞，也有助于鉴别诊断某些血液疾病。

过碘酸Schiff染色是用强氧化剂打开血细胞多糖乙二醇基生成醛基，然后醛基与Schiff试剂发生加成、缩合反应，使无色的亚硫酸品红失去亚硫酸而经分子重排，恢复品红对醌型结构显示红色阳性产物沉淀于胞质糖原成分区域。所以Schiff试剂应严置暗处，一旦受空气和光氧化后无色的亚硫酸品红分解，试剂变红，染色效力随之降低。配制Schiff试剂用的碱性品红因商品不一，效果不同。若遇到质量差的品红可适当等比例提高品红和偏重亚硫酸钠的量。染色中二氧化硫冲洗步骤可省略。

（6）质量保证：

试剂的正确配制和质量（前述）是染色质量保证的关键，其次是染色后尽快阅片分析，因红色的阳性产物会随时间逐渐退去。

（7）正常细胞参考反应：

造血系统中，糖原主要分布在髓系细胞。髓系原始粒细胞糖原含量很低，随着细胞成熟，糖原含量逐渐增加。中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的PAS阳性颗粒可被淀粉酶水解，为糖原。嗜碱性粒细胞的PAS阳性颗粒不能被淀粉酶水解为糖胺聚糖。单核细胞糖原含量较少，呈细粒状。淋巴细胞糖原常凝聚成颗粒或块状。巨核细胞和血小板系统含有丰富的糖原，PAS反应呈粗大的紫色颗粒或团块。正常红系细胞不含糖原。

（8）临床意义：

主要用于白血病的鉴别诊断：①M7，白血病原始细胞呈显著的块状或弥漫性强阳性时，结合多形性嗜碱性胞质和突起的特点，可疑似此型白血病；②M6与MA，M6幼红细胞PAS染多呈阳性反应，而MA几乎全为阴性；③原始粒细胞、原始淋巴细胞与原始单核细胞白血病，糖原成分以原始粒细胞最低，原始淋巴细胞最高，原始单核细胞最强；④其他，MDS幼红细胞可出现PAS阳性。Gaucher细胞PAS强阳性，Niemann-Pick细胞PAS为阴性或弱阳性，可用于两者的鉴别。不典型巨核细胞与Reed-Sternberg（R-S）细胞，前者PAS强阳性，后者弱阳性或阴性；非霍奇金淋巴瘤细胞与骨髓瘤细胞，前者阳性，后者阴性或弱阳性。CLL的淋巴细胞多呈阳性反应，HCL约一半阳性。Sezary细胞阳性。转移骨髓的腺癌细胞阳性。

（二）细胞免疫化学染色技术

细胞免疫化学染色是形态学鉴别诊断方法的一种补充，用于骨髓涂片最常用的方法是碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase，APAAP）法。

1.原理

抗碱性磷酸酶单克隆抗体与碱性磷酸酶结合形成的复合物为第三单抗，小鼠杂交瘤单克隆抗体为第一抗体，兔抗-鼠免疫球蛋白为第二抗体，通过碱性磷酸酶细胞化学染色，显示抗原存在部位。

2.试剂与质控物

常用试剂有固定液、单抗（根据需要选取不同种类）、第二抗体、阳性质控物、阴性质控物、APAAP复合物、底物液、坚固红TR盐、复染液等。

质控物应准备阳性和阴性，有条件或可能，每个单抗检测时应有各自的质控物。阳性质控物用已知的阳性涂片，阴性质控可用患者自身标本，用PBS或稀释的非免疫动物血清替代第一抗体。

3.操作步骤

外周血或骨髓细胞涂片干燥2小时后，用固定液固定3～5分钟，0.01mol/L（pH 7.2）磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗2分钟，干后用画圈笔画圈或在涂片上划痕；在圈内加第一单抗（按病理变化的要求选定）约50μl，室温60分钟；PBS漂洗3分钟，3次，吸去液体后加第二抗体约50μ1，室温30分钟；PBS漂洗3分钟，3次，吸去剩余液体后加APAAP复合物约50μl，室温30分钟；PBS漂洗3分钟，3次，吸去液体后加碱性磷酸酶底物显色液显色15～30分钟；PBS漂洗，流水冲洗，苏木精溶液复染1～3分钟，流水冲洗，晾干镜检。

4.结果判定与解释

阴性质控标本为所有细胞不显红色沉淀物，阳性反应被染成棕红色，定位于胞质。细胞免疫化学染色结果解释应与临床和其他实验室所见，包括传统的血液和骨髓涂片形态学检查相结合。

5.方法学评价

该法是用于血片和骨髓涂片的较佳方法，也是临床应用于识别小巨核细胞和测定T细胞亚群最多的细胞免疫化学染色。在染色操作中，加入第一抗体时注意抗体溢出，若第一抗体溢出与其他第一抗体混合便失去检测意义；加入第一抗体和第二抗体温育时必须在湿盒内进行，如果加入第一抗体或第二抗体的温育中，不能出现圈内片膜干涸现象。

6.质量保证

保证APAAP染色尤其需要加强以下几个环节：一是标本规范固定，时间过长可影响细胞表面抗原活性，不同固定液会发生不同的染色反应，除非经实验证实，否则不能更改固定液；二是抗体效价要适当，效价稀释过高过低都影响结果反应，一抗和二抗保存不当也影响结果，因此每次染色不但要注意抗体效价问题，还需要作质控标本对照；三是用画圈笔画圈或用锐器在涂片上划痕的内面积不应 ＜ 0.6cm×0.6cm，面积不小不利于化学反应和镜检；四是在染色操作中，重复加二抗、漂洗、加APAAP复合液，可提高阳性的色泽反应，而发生圈内片膜干涸时则显著影响反应结果；五是用固红或固蓝染色后，避免酒精接触（酒精可使阳性色泽退色）。

7.临床应用评价

在形态学常规诊断中，细胞免疫化学染色使用较多的有 CD41、（抗）MPO、（抗）溶菌酶、CD68、CD38、CD79、CD3等。其重要价值体现在2个方面：其一是用于造血和淋巴组织肿瘤类型的鉴定和鉴别诊断，如用抗MPO等染色鉴别原始粒细胞与原始淋巴细胞（图4-137a、b）；其二是辅助鉴别Wright-Giemsa染色不易识别的细胞类型，如无形态学特征的原始巨核细胞（图4-137c）和微小巨核细胞（图4-138）、浆细胞与幼红细胞、吞噬性血小板与病原微生物等。微小或原始巨核细胞多见于髓系肿瘤，尤其是慢性粒细胞白血病加速期和急变期，以及部分骨髓增生异常综合征、急性髓细胞白血病和特发性骨髓纤维化。CD41或CD42染色后观察血小板，血小板染为鲜红色，结果也更容易察觉（图4-138），甚至在特发性血小板减少性紫癜标本中，亦能观察到比Wright-Giemsa染色为多的散在和小簇状血小板。

二、骨髓切片组织化学和免疫化学染色技术

（一）骨髓切片组织化学染色技术

骨髓切片组织化学染色方法有许多种，染色试剂和染色过程与骨髓涂片细胞化学染色相同，主要差别在于标本的不同和处理。下面介绍最常用的Gomori网状纤维染色和铁染色。

1.Gomori网状纤维染色

（1）试剂配制：

①含氨银溶液：取100g/L硝酸银溶液10ml（4份），加 100g/L 氢氧化钾水溶液 2.5ml（1份），溶液混合后当即发生灰黑色沉淀。往沉淀的溶液中一滴滴地滴加25%的氨水，并不停地摇动容器，直至沉淀物完全溶解即停止滴入氨水（约需2.5ml），然后小心地滴加10%硝酸银溶液0.5ml，直至溶液稍变混浊，出现振摇后易消失的沉淀物为止。最后，在此溶液内添加蒸馏水30ml。使用的玻璃器皿应除酸，试剂宜临用前配制，配制后可保持24～36小时。②5g/L高锰酸钾溶液：高锰酸钾0.5g，加蒸馏水100ml。③20%甲醛溶液：甲醛液20ml，加蒸馏水80ml。④20g/L偏重亚硫酸钾溶液：取偏重亚硫酸钾2g，加蒸馏水100ml。⑤20g/L硫酸铁（Ⅲ）铵溶液：取硫酸铁（Ⅲ）铵2g，加蒸馏水100ml。⑥0.2%氯化金溶液（黄色）：取贮存的氯化金溶液20ml，加蒸馏水80ml。

（2）操作步骤：

切片用高锰酸钾溶液氧化1分钟，流水冲洗2分钟，吹干；偏重亚硫酸钾溶液脱色1分钟，流水冲洗2分钟，吹干；硫酸铁（Ⅲ）铵溶液中敏化1分钟，流水冲洗2分钟，吹干后再用蒸馏水漂洗2次，每次30秒，吹干；浸入银溶液内1～2分钟，蒸馏水漂洗20秒；20%甲醛溶液内还原3分钟，流水洗3分钟，吹干；氯化金溶液调色10分钟（用coplin染色缸），蒸馏水漂洗，吹干；中性树胶封片，镜检。

（3）结果判定：

网状（网硬蛋白）纤维黑色；胶原纤维呈紫红色；胞核与胞质呈不同色调的灰色。

网状纤维积分标准：“±”，偶见纤细或粗大的单一纤维丝，或在单一纤维丝散在分布的同时，可见血管周围的局限性纤维网络，或良性淋巴滤泡四周的局限性纤维网络；“+”，轻度增多，可见贯穿于切片大部分区域的纤细纤维网络，粗大纤维偶见；或者于血管及良性淋巴滤泡附近的局限性网硬蛋白纤维增多；“++”，为网状纤维增加，可见弥漫性纤维网络，伴有散在性分布的粗纤维增多现象；“+++”，为弥散性网状纤维明显增加；”++++”，为弥散性粗纤维网络，密集分布（图4-139）。

（4）质量保证：

Gomori染色过程较为复杂，在脱色、敏化、显色、还原和调色的每一步都应严格按照操作步骤执行。2次蒸馏水漂洗是关键，必须充分。染色试剂配制好后应在24小时内使用，特别是银氨溶液（久存后溶液混浊而影响染色效果），如果室温过高，又不立即使用，可将其先放置4℃冰箱。配制银氨溶液的玻璃缸不能接触自来水，有时刚配制好的银氨溶液马上变混浊，此时应将其倾去，用蒸馏水将玻璃缸冲洗数分钟后再配制。2次检验染色效果的步骤：银氨溶液染色后组织块变黄；20%甲醛溶液染色后组织块变黑。20%甲醛溶液还原后，必须用流水充分冲洗5分钟。最后一步0.2%氯化金调色时应使组织块完全浸于溶液中，这样染出的颜色比较均匀，易于观察。

（5）正常参考反应：

正常骨髓组织切片为“-”和“±”。光镜下，网状纤维十分纤细，呈“丫”状、直线状、曲线状等形态，主要集中在血管周围。

（6）临床意义：

网状纤维又名网硬蛋白，是胶原纤维的前身，由成纤维细胞产生，病理情况下网状纤维增多伴有胶原纤维增加，分布于造血细胞之间，可成片出现，呈粗的长条状和卷曲状。网状纤维染色是评判骨髓纤维组织增生的唯一检验，主要用于诊断原发的和继发的骨髓纤维化（网状纤维“++～++++”），造血和淋巴组织肿瘤（如MDS和AML）伴有明显的纤维组织增生可提示预后差。

2.铁染色（普鲁士蓝反应）

（1）试剂：

亚铁氰化钾溶液；促染溶液；中性红复染液。

（2）操作步骤：

将亚铁氰化钾和促染剂等量混合后滴加于切片上室温孵育10～20分钟；蒸馏水充分洗涤；滴加1滴中性红复染液复染5～10分钟，蒸馏水洗涤，吹干；中性树胶封片，镜检。

（3）结果判定：

含铁血黄素呈蓝色，胞核呈红色。排除非特异性污染吸附，骨小梁、脂肪细胞空泡内或无组织、无细胞的区域出现蓝色物质，均视为非特异性着色。

骨髓切片含铁血黄素（巨噬细胞铁）阳性分级标准：“-”无阳性颗粒；“+”间质少量散在蓝色颗粒和/或巨噬细胞的胞质有蓝色颗粒；“++”间质中和巨噬细胞胞质中较多蓝色颗粒或小珠；“+++”间质中及巨噬细胞胞质内蓝色颗粒、小珠或小团块，分布广泛；“++++”除散在蓝色颗粒、小珠外，并见小团块成堆分布。细胞内铁评判同涂片铁染色，但切片中铁粒幼细胞的铁粒清晰性不及涂片。

（4）方法学评价：

目前常用的是普鲁士蓝染色法，骨髓切片染色是判断铁贮存多少的“金标准”，方法学的诊断性能可能比骨髓涂片更佳。

（5）质量保证：

所用蒸馏水应不含铁离子，切片（塑料包埋标本）为5μm厚，薄片染铁效果差。染色时，染色液必须充分掩盖组织（切片上呈溢满状）。其他参考骨髓涂片铁染色。

（6）正常参考反应：

正常骨髓组织切片含铁血黄素为“+”。

（7）临床意义：

骨髓切片铁染色也是评估机体铁缺乏的最佳指标，主要用于骨髓含铁血黄素（贮存铁）减低疾病（如IDA）的诊断和增加疾病（如SA、RA、MA、AA）的辅助诊断。IDA时骨髓贮存铁消失，幼红细胞铁粒不见或少见；MA、AA和MDS等，骨髓贮存铁增加（图4-140），可达“+++～++++”，铁粒幼细胞多见，可见环形铁粒幼细胞。

（二）骨髓切片免疫组化染色技术

免疫组化染色（immunohistochemistry，IHC）一般适用于石蜡包埋切片。目前常用两步法。

1.两步法免疫组化染色

（1）步骤过程：

依次为切片脱蜡至脱水；3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶室温20分钟，水洗；根据需要进行必要的抗原修复（高温热修复、酶修复或不修复，根据第一抗体决定）；pH 7.2 PBS缓冲液洗3次，每次1分钟；滴加第一抗体室温1小时或37℃温箱孵育30～60分钟或4℃冰箱过夜；pH 7.2 PBS缓冲液洗3次，每次1分钟；滴加酶复合物室温或37℃孵育20～30分钟；pH 7.2 PBS缓冲液洗3次，每次1分钟；DAB显色3～10分钟，镜下控制着色；水洗终止显色；苏木素淡染细胞核1～2分钟；水洗、蓝化；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

（2）阳性细胞特征：

免疫组化呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。阳性细胞染色分布有三种类型：细胞质、细胞核和细胞膜表面；大部分抗原见于细胞质，可见于整个胞质或部分胞质。阳性细胞分布可分为灶性和弥漫性。由于细胞内含抗原量不同，所以染色强度不一，如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。

2.全自动免疫组化染色

随着全自动免疫组化仪的推广和普及，使得免疫组化的操作和结果更为规范化和标准化；部分全自动免疫组化仪在检测系统增加增强剂，有的在抗原修复、抗体孵育等环节增加专利增强技术，使得免疫组化阳性结果的强度和阳性率大大提高。

3.免疫组化分析

免疫组化是骨髓组织病理学诊断中非常重要的一项指标。除了排除技术因素外，在分析中需要密切结合临床特征、细胞学特征、组织学特征和抗体的种类，有针对性地进行。如AML，由于原始细胞常呈弥散性浸润，标记染色容易观察和评判；但当原始细胞比例不明显高或伴有细胞成熟时，就不容易可靠评判原始细胞，尤其是MPO、溶菌酶、CD33。淋巴瘤因侵犯骨髓的程度显著不一，且一些抗原的表达常有缺失或重叠，更需要综合性和针对性地进行观察。此外，亟须探讨免疫组化不同疾病中半定量评判的共识。

（卢兴国）