第三节 PCR的原理、技术分类和常见PCR仪种类

一、PCR的原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA在体外95℃左右高温时发生变性，会变成单链，低温（60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调节温度至DNA聚合酶最适宜反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5′→3′）的方向合成互补链。

PCR反应体系包括5种基本成分，分别为模板DNA、引物、4种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶、Mg2+等。

二、PCR反应基本过程

PCR反应由变性、退火和延伸3个基本反应步骤构成。

1.模板DNA的变性

是95℃左右的高温使DNA双链碱基对的氢键断裂，使双链变为单链的过程。模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便其与引物结合，为下一轮反应做准备。

2.模板DNA与引物的退火（复性）

低温下（60℃左右），引物与模板DNA根据碱基互补配对原则进行互补配对，形成杂交分子的过程。模板DNA经加热变性成单链DNA后，温度降至40～60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

3.引物的延伸

在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+存在的情况下，DNA聚合酶催化引物按5′→3′的方向合成出与模板DNA单链互补的DNA子链。

DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTPs为反应原料、靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复PCR循环过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下一次PCR循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大10万到几百万倍。以上述3个步骤为一个PCR循环，每一个PCR循环的产物均可作为下一个PCR循环的模板，经过N次循环后，待扩增的DNA片段以2n指数形式增加（图 1-5）。

三、PCR技术的分类

1.反向PCR（inverse PCR，IPCR）技术

反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法。主要原理是用一种在已知序列中无酶切位点的限制性内切酶消化基因组DNA后，使酶切片段自身环化。以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基因侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。

2.锚定PCR（anchored PCR，APCR）技术

用酶法在一通用引物反转录cDNA 3′末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增，称为APCR。

3.不对称PCR（asymmetric PCR）技术

两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称为不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度，常用（50～100）∶1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度引物被消耗殆尽后，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。

4.反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）技术

当扩增模板为RNA时，须先通过反转录酶将RNA反转录为cDNA才能进行扩增。此方法应用非常广泛，无论是分子生物学实验还是临床检验等都经常采用。

5.巢式PCR（NEST-PCR）技术

先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量，然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR产物，此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤，可将外引物设计得比内引物长些，且用量较少，同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度。这样在第一次PCR时，由于较高退火温度下内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物。经过若干次循环，待外引物基本消耗尽，无须取出第一次PCR产物，只需降低退火温度即可直接进行PCR扩增。这不仅减少了操作步骤，同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR被称为中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。

6.多重PCR（multiplex PCR，mPCR）技术

在同一反应中用多对引物同时扩增几种基因片段。如果基因的某一区段有缺失，则相应的PCR扩增产物电泳谱上这一区带就会消失。多重PCR主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

7.重组PCR技术

重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中，两对引物分别由其中之一在其5′端和3′端引物上带上一段互补的序列，混合两种PCR扩增产物，经变性和复性，两组PCR产物互补序列发生粘连，其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应，产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

8.原位PCR技术

利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。

9.荧光定量实时PCR技术

是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

四、PCR扩增仪的常见分类

（一）普通PCR仪

1.普通PCR仪

一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称为普通PCR仪，也称传统PCR仪。如果要做不同的退火温度需要多次运行，主要用于对单一退火温度的基因进行扩增。该仪器主要应用于科学研究、教学、医学临床、检验检疫等机构。

2.梯度PCR仪

一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度，通常有12种温度梯度）的PCR仪，称为梯度PCR仪。因为被扩增的DNA片段不同，其合适的退火温度也是不同的。通过设置一系列的梯度退火温度进行一次性扩增，就可以筛选出表达量高的合适退火温度的靶序列，进行有效扩增。该PCR扩增仪用于研究未知DNA退火温度的扩增，节约成本的同时也节约了时间。梯度PCR仪在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增，主要应用于科研、教学机构。

3.原位PCR仪

用于细胞内靶DNA定位分析的基因扩增仪称作原位PCR仪，如致病基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。该方法可保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在位置上进行基因扩增。原位PCR仪既可以检测到靶DNA，又能标出靶序列在细胞内的位置，对于在分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程及病理的转变有重要的实用价值。原位PCR仪主要应用于临床、科研。

（二）实时荧光定量PCR仪

在普通PCR仪的基础上，增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统的PCR仪称作荧光定量PCR仪（Q-PCR）。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物利用荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。荧光信号采集系统实时采集信号，输送扩增结果到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。荧光定量PCR仪包括单通道、双通道和多通道。当只用一种荧光探针标记时，选用单通道，有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光标记的目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需要多次扩增才能检测不同目的基因片段的量。荧光定量PCR仪主要用于医学临床检验、生物医药研发、食品、科研院校等机构。

（三）数字PCR仪

数字PCR（digital PCR，dPCR），是一种基于泊松分布原理建立的核酸分子体外扩增绝对定量检测技术。通过将待测样本进行极限稀释，使每个PCR反应微滴中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子。然后加入荧光信号进行PCR扩增，可以检测到低至一个拷贝。数字PCR是实时荧光定量PCR原理与现代微机电、微纳制造工程技术相结合的典范。数字PCR的核心是将核酸样品平行划分为大规模单分子水平的微反应单元，然后对众多微反应单元内的靶序列进行扩增和光学检测，实现绝对定量和痕量分析。

目前dPCR主要有芯片式和微滴式两种形式，但基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应的核酸模板数≤1个。经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，结合泊松分布原理，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。