第五节　溶血性贫血

溶血性贫血（hemolytic anemia，HA）是指由于某种原因导致红细胞病理性破坏增加，寿命缩短，骨髓代偿能力不能补偿所引起的一类贫血。溶血性贫血属于增生性贫血，骨髓对贫血的刺激有强大的代偿功能，可增加到正常的6~8倍，故本病是以红细胞的破坏增加和红细胞生成活跃同时并存为特征的一组疾病。

按溶血的场所分为血管内溶血（红细胞主要在血液循环中破坏）和血管外溶血（红细胞主要在组织巨噬细胞胞质中被破坏）；根据发病机制将溶血性贫血分为遗传性和获得性两大类。血管内溶血多是由于红细胞内在缺陷，红细胞在血管内被直接破坏，血红蛋白进入血浆，临床以血红蛋白血症和血红蛋白尿为主要特征，遗传性多见。血管外溶血多由于外在溶血因素所致，红细胞被单核吞噬细胞系统破坏，血红蛋白不直接释放进入血浆而是通过色素代谢变成胆红素，临床上以高胆红素血症和肝、脾肿大为主要特征。遗传性溶血性贫血多由于红细胞内在的缺陷（包括膜、酶、血红蛋白合成异常）所致，而G6PD缺乏症当外在因素不存在时多不发病；获得性溶血性贫血多由红细胞外在缺陷（包括免疫因素、药物因素、生物因素、物理因素等）所致，但阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）例外，它是获得性的以红细胞内在缺陷为特征的溶血性疾病。

由于溶血性贫血是非常复杂的一类综合征，其病种繁多，发病机制和病因各异，对其进行诊断和鉴别诊断都较困难。一定要明确溶血的病种，通过实验室的检查可对不同的溶血性贫血进行诊断和鉴别诊断。免疫相关溶血性贫血（immune hemolytic anemia）的内容见第二十一章。

一、实验室分析路径

溶血性贫血可为红细胞内在缺陷和红细胞外在因素所致，按病因学分类可分为红细胞膜缺陷、红细胞酶缺陷、血红蛋白异常及红细胞外在缺陷等，实验室分析路径见图1-5、图1-6。

二、相关实验

溶血性贫血的血液学特征表现为骨髓造血活动的增强以及红细胞破坏的增加，诊断溶血性贫血的病因时应将全血细胞计数和后续的病因诊断实验结果进行分析，尤其是红细胞形态学检查，对溶血性贫血的鉴别诊断具有重要意义。溶血相关实验主要分为显示溶血的检测及红细胞膜、红细胞酶、血红蛋白异常的相关病因诊断实验等。

1.显示溶血的相关检测

（1）血浆游离血红蛋白检测：

利用血红蛋白具有类过氧化物酶活性的特点，采用过氧化物酶法检测血浆游离血红蛋白（plasma free hemoglobin）。正常参考范围为0~40mg/L。正常情况下，血浆中游离血红蛋白极微，且大部分与结合珠蛋白结合，仅有微量游离血红蛋白。血管内溶血性贫血时，血浆游离血红蛋白明显增高。

（2）血清结合珠蛋白：

血清结合珠蛋白（haptoglobin，Hp）可与血浆中游离的Hb结合形成复合物，此复合物在单核-吞噬细胞系统和肝内被消除。溶血时血浆中增加的游离血红蛋白与Hp结合，消耗血清中结合珠蛋白使其含量减少，测定血清中结合珠蛋白的含量可反映溶血的情况。临床上常用的检测Hp的方法有电泳法、比色法、速率散色比浊法等。电泳法正常参考范围（164名健康成人的测定结果）为，血清Hp含量为（742±420）mg Hb/L。其中男54人，Hp含量（742±360）mg Hb/L，女110人，Hp含量（726±372）mg Hb/L。

（3）血浆高铁血红素白蛋白检测：

血浆中游离的血红蛋白可被氧化为高铁血红蛋白，再分解为珠蛋白和高铁血红素，后者先与血中的血红蛋白结合，血红蛋白消耗完后，高铁血红素与白蛋白结合形成高铁血红素白蛋白（methemalbumin）。正常人呈阴性，血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。

（4）尿含铁血黄素试验：

又称Rous试验，当血红蛋白通过肾小球滤过时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。正常人为阴性。慢性血管内溶血时本试验为阳性。

（5）红细胞形态：

溶血性贫血患者外周血红细胞形态主要以裂红细胞增多为主，可见泪滴红细胞，椭圆形红细胞，球形红细胞、嗜碱性点彩红细胞等，异形红细胞比例可高达50%。

2.诊断红细胞膜缺陷的检测

（1）红细胞渗透脆性试验及渗透脆性孵育试验：

本试验检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。红细胞抵抗力大小取决于红细胞表面积与体积的比值，比值愈小，红细胞抵抗低渗盐溶液的能力愈差，渗透脆性增加；反之抵抗力增大，渗透脆性减低。而经24h 37℃孵育消耗红细胞的ATP和能量，再观察红细胞在不同浓度的低渗盐溶液中溶血情况为孵育后脆性。正常情况开始溶血：3.8~4.6g/L NaCl溶液，完全溶血：2.8~3.2g/L NaCl溶液。遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血性贫血时渗透脆性增加，珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白C、D、E病，低色素性贫血、阻塞性黄疸、脾切除术后等渗透脆性减低。

（2）红细胞膜三磷腺苷活性测定：

Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶都是红细胞膜上的 ATP酶。参考范围为：红细胞膜 Na+-K+-ATP 酶：19.68±3.62µmol Pi·gHb-1·2h-1；Ca2+-Mg2+-ATP酶：142.22±13.50µmol Pi·gHb-1·2h-1。遗传性球形红细胞增多症时红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性增加，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性减低。蚕豆病时红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性减低。

（3）酸化甘油溶血试验：

当红细胞膜蛋白及膜脂质有缺陷时，在pH 6.85的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至50%的时间（AGLT50）明显缩短。正常人AGLT50 > 290s，遗传性球形红细胞增多症AGLT50明显缩短（25~15s）。自身免疫性溶血性贫血、肾衰竭、妊娠等AGLT50也可缩短。

（4）红细胞膜蛋白电泳分析：

应用SDS-PAGE电泳对红细胞膜进行分析，根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分的百分率：区带1、2（收缩蛋白）、区带 2.1（锚蛋白）、区带 3（阴离子通道）、区带 4.1、区带 4.2、区带 4.5（葡萄糖运转蛋白）、区带 4.9、区带 5（肌动蛋白）、区带6（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、区带7等。各种膜缺陷疾病如遗传球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常。但红细胞膜蛋白电泳结果不够精确，仅局限于定性或半定量研究。

（5）高渗冷溶血试验：

在高渗的条件下，温度骤降影响红细胞膜脂质的流动性，并累积膜磷脂和膜骨架蛋白的结合位点，从而导致红细胞破裂溶血。参考值9mmol/L或12mmol/L蔗糖：66.5%~74.1%；7mmol/L蔗糖：0.1%~16.9%。增加见于遗传性球形红细胞增多症，降低见于珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病。自身免疫性贫血基本正常。

（6）红细胞膜蛋白基因检测：

利用分子生物学技术检测遗传性红细胞膜缺陷与某个基因的相关性，或者检测膜蛋白基因的突变位点。遗传性球形红细胞增多症的突变位置多在CpG二核苷酸，缺失或插入。

3.诊断红细胞酶缺陷的检测

（1）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose 6 phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏的筛检试验：

目前国内常用的有高铁血红蛋白还原试验、荧光斑点试验和变性珠蛋白生成试验。高铁血红蛋白还原试验敏感性高；荧光斑点试验特异性高，同时是国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐的G6PD缺乏筛查方法。Heinz包涵体试验主要在溶血期间呈阳性。上述筛检试验均不能准确检出女性红细胞G6PD缺乏的杂合子。

高铁血红蛋白还原试验：正常人外周血高铁血红蛋白还原率大于或等于75%；脐血大于或等于77%。G6PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。蚕豆病和服用伯氨喹型药物导致的溶血性贫血等患者，还原率均可出现下降的结果。G6PD中间缺乏值（杂合子）还原率为31%~74%，脐血为41%~76%；G6PD严重缺乏值（纯合子）还原率小于或等于30%，脐血小于40%。其简便易行，但该试验耗时长，特异性较差。

荧光斑点试验：NADPH在紫外线260~340nm照射发出绿色荧光，而NADP+无荧光。利用此试验可对高发区域人群或疑诊的新生儿进行筛查。正常5~10min斑点出现荧光，而10min斑点荧光最强。

变性珠蛋白小体生成试验：可作为G6PD缺乏的筛检试验之一，正常人 < 1%。而阳性细胞百分率大于30%有临床意义，G6PD缺乏症常高于45%，但含有不稳性血红蛋白的患者阳性细胞也大于30%，还原型谷胱甘肽缺乏症也增高。

（2）G6PD确诊实验：

G6PD活性定量检测能准确反映酶的活性。检测多应用WHO推荐的改良Zinkham法、国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐的Glok与McLean法，Chapman-Dern法和硝基四氮唑蓝定量法。由于G6PD杂合子患者酶活性的变化范围较宽，活性定量测定的方法对其检出率不高，可通过同时测定G6PD/6PGD比值的变化较敏感地反映G6PD的缺乏，提高杂合子的检出率。成人红细胞G6PD活性为8~18U/g Hb。

（3）G6PD基因检测：

基因检测对于疾病的分子诊断、探讨G6PD结构与功能的关系以及完善人类遗传学资料有重要意义。目前编码G6PD的DNA一级分子结构已完全清楚，利用分子生物学技术可进行核苷酸序列分析。利用限制性内切酶研究G6PD基因片段长度多态性，对分析变异型很有帮助。目前中国人群发现G6PD基因28种变异型，G1388A、G1376T和A95G是中国人常见的突变型。

（4）丙酮酸激酶筛检试验：

红细胞自溶血试验阳性，加ATP可完全纠正，加葡萄糖不能纠正。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）荧光斑点试验，正常者25min内荧光消失，中等缺乏者（杂合子型）25~60min荧光消失，严重缺乏者（纯合子型）60min荧光仍不消失。

（5）丙酮酸激酶活性定量测定：

在二磷酸腺苷（ADP）存在的条件下，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化成丙酮酸，后者在乳酸脱氢酶（LD）催化下转化为乳酸，同时使反应体系中还原型辅酶Ⅰ（NADH）氧化成NAD+。计算单位时间NADH减少量来求得PK活性。ISCH推荐，正常参考区间为（15.0±1.99）U/g Hb（Blume法）；中等缺乏者（杂合子型）为正常活性的25%~35%，严重缺乏者（纯合子型）为正常活性的25%以下。

（6）ATP测定：

参考范围（4.32±0.29）μmol/g Hb，PK缺乏时低于正常2个标准差以上。

（7）PK缺乏症患者的分子诊断：

突变或缺失位点可位于外显子、内含子及启动子区域，一般是将所有外显子、内含子和PK-LR的红细胞特异性启动子区域进行PCR扩增后分别测序以发现突变位点所在。

4.诊断血红蛋白异常的检测

（1）血红蛋白电泳：

血红蛋白电泳（hemoglobin electrophoresis）包括醋酸纤维素薄膜电泳、等电聚焦法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳以及高效液相色谱法。

pH 8.6 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳：正常血红蛋白电泳区带为：HbA > 95%、HbF < 2%、HbA2为1.0%~3.12%。pH 8.6 TEB缓冲液适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开，HbH与Hb Barts不能分开和显示。故pH 8.5醋酸纤维薄膜电泳未分离出异常血红蛋白区带不能完全排除异常血红蛋白的存在，应用等电聚焦电泳、高效液相色谱等技术可提高检出率。

毛细管电泳：是一种以高压直流电场为驱动力，以样品中各组分的淌度（单位电场强度下的迁移速度）和分配行为的差异为根据的液相微分离分析技术。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：血红蛋白液中加入裂解剂，使Hb分子空间结构破坏，裂解成多条肽链亚单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离鉴别。参考值：正常血红蛋白裂解后出现β、γ、δ、α四条肽链，如在正常区域以外的区带出现条带，提示异常血红蛋白存在。

高效液相色谱法：以离子交换树脂为固定相，根据血红蛋白的理化性质不同，利用携带负电荷的层析柱和珠蛋白成分的电荷差异进行分离。

（2）抗碱血红蛋白检测：

胎儿血红蛋白（HbF）具有比HbA更强的抗碱作用，将待检的血红蛋白液与一定量的NaOH溶液混合，以检测抗碱血红蛋白的浓度。此试验也称为碱变性试验，除HbF外，Hb Barts和部分HbH也具有抗碱能力。参考值：成人1.0%~3.1%，新生儿55%~85%，2~4个月后逐渐下降，1岁左右接近成人水平。珠蛋白生成障碍性贫血时HbF增加，重型者达30%~90%，中间型常为5%~30%，轻型小于5%。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，HbF可高达100%。HbF相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤等恶性疾病及再生障碍性贫血、PNH、卟啉病等。HbF生理性增多，见于孕妇及新生儿。

（3）红细胞包涵体试验：

红细胞包涵体试验（Heinz-body forming test）是检测不稳定血红蛋白易变性沉淀形成的包涵体，正常人为阴性结果。不同型的不稳定血红蛋白所需温育时间和形成包涵体的大小、形态、数量、分布可有不同。HbH病时可见包涵体，也叫HbH包涵体。G6PD缺乏或红细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等红细胞中也可出现包涵体。本试验是不稳定血红蛋白特别是HbH诊断的筛选试验。正常0~5%。

（4）异丙醇沉淀试验：

因不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易解裂，在异丙醇这种能减低血红蛋白分子内部的氢键的非极性溶剂中，不稳定血红蛋白的稳定性下降，比正常血红蛋白更快地沉淀。正常人脐血为阳性结果，新生儿出生1个月后逐渐开始转为阴性，6个月后血红蛋白液为阴性。在HbF、HbH、HbE含量大于4%、G6PD缺乏、α-珠蛋白生成障碍性贫血时均可出现阳性结果。试验结果阳性只能说明存在不稳定血红蛋白。本试验易出现假阳性，特异性较差，是不稳定血红蛋白的筛选试验。

（5）热变性试验：

也称为热不稳定试验（heat instability test），其根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性的特点，观察血红蛋白液在50℃时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。热沉淀血红蛋白超过5%提示不稳定血红蛋白存在。

（6）血红蛋白分子生物学技术检测：

应用基因探针、DNA微阵列、限制性内切酶图谱分析、聚合酶链反应（PCR）、扩增不应突变系统技术、多重突变引物延伸扩增技术、反向斑点杂交、特异性寡核苷酸杂交等一系列分子生物学技术，可检测出异常血红蛋白基因的存在，明确基因型及基因的缺陷部位等。通过血红蛋白异常基因的检测，可在分子水平上进行血红蛋白病的诊断和研究，具有重要的临床诊断价值。

5.阵发性睡眠性血红蛋白尿症的检测

（1）酸化血清溶血试验：

阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）患者体内红细胞有缺陷，对补体敏感性增加。酸化血清溶血试验（acidified-serum hemolysis test），也称微量Ham’s test，正常人为阴性，本试验阳性主要见于PNH，某些自身免疫性溶血性贫血发作严重时可呈阳性。该检测特异性强，是PNH的确诊试验。

（2）蔗糖溶血试验（sucrose hemolysis test）：

PNH患者的红细胞膜有缺陷，在低离子强度的蔗糖溶液中对补体敏感性增强，经孵育，补体与红细胞膜结合加强，使补体敏感红细胞的膜造成缺损，结果导致蔗糖溶液通过缺损处进入红细胞内，引起渗透性溶血。正常人定性试验为阴性，定量试验溶血率 < 5%。本试验敏感性高，作为PNH的筛选试验，阴性可排除。蔗糖试验特异性较差，AA-PNH综合征患者亦可阳性，白血病、骨髓硬化时可出现假阳性，部分自身免疫性溶血性贫血、巨幼细胞贫血、遗传性球形红细胞增多症患者可呈弱阳性，阳性需加做Ham’s试验。

（3）CD55、CD59检测：

阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）的发病机制是血液细胞膜表面糖化磷脂酰丝氨酸锚蛋白的缺失，可通过检测CD55（退变加速因子）和CD59（反应性溶血膜抑制物）这两种常见的血细胞表面锚蛋白相关抗原的表达情况，辅助诊断PNH。正常人红细胞CD55、CD59及粒细胞CD55、CD59表现为单一阳性峰，低表达群应小于3%。若在检测标本中发现有CD55或CD59低表达群的增多，支持PNH诊断。本试验是诊断PNH特异性高、敏感性强且可定量的检测方法。

（4）蛇毒因子溶血试验（venom hemolysis test）：

多采用从眼镜蛇毒中提取的一种蛇毒因子（C3b），可通过旁路途径激活补体，PNH患者的红细胞补体系统激活后，促使PNH补体敏感红细胞破坏、溶血。正常人溶血率 < 5%，溶血率 > 10%为阳性。PNH Ⅲ型红细胞对蛇毒溶血试验敏感性最高，正常红细胞、PNHⅠ型和PNHⅡ型等的红细胞均不发生溶血。本试验为PNH特异性试验，特异性比Ham’s试验高，溶血度越高，说明PNH Ⅲ型红细胞所占比例越多。

（5）血细胞Flaer测定分析：

嗜水气单胞菌的毒素能特异与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，在膜上打孔致细胞破裂溶解。而PNH细胞缺乏GPI锚连蛋白抵抗毒素破坏，保持细胞完整。利用荧光素标记Flaer变异体，通过流式细胞术区分GPI阳性和阴性细胞。健康人Flaer呈100%阳性。目前采用Flaer联合CD59来检测PNH，对于临床高度怀疑，CD55和CD59检查不能确诊的病例，结合Flaer检查，可提高诊断。

三、结果判断与分析

（一）首选试验

确定溶血性贫血存在的检验：依据病史，有贫血、黄疸，网织红细胞计数增加，考虑为溶血性贫血的可能。溶血性贫血的诊断主要应寻找的证据有：①红细胞寿命缩短或破坏过多：红细胞寿命测定明显缩短，血红蛋白浓度减低，异形红细胞较多出现，血中游离血红蛋白浓度增加，血清间接胆红素增加，尿胆原阳性，尿含铁血黄素试验阳性，血清乳酸脱氢酶活性增加等；②骨髓红细胞系统代偿性增生：网织红细胞明显增多，骨髓红系增生明显活跃，粒红比例缩小或倒置。

（二）次选试验

确定溶血病因明确诊断的检验：依据病史找线索，并结合其临床资料有的放矢地选择筛选试验和确诊试验，对不同类型的溶血性贫血进行确诊。如遗传性溶血性贫血选择红细胞渗透脆性试验，自身溶血试验，红细胞酶缺陷的检出，血红蛋白电泳，异常血红蛋白的检测等；获得性溶血性贫血选择抗人球蛋白试验、冷凝集素试验、冷热溶血素试验、血清蛋白电泳等；药物所致溶血性贫血选择高铁血红蛋白检测、G6PD筛选试验、包涵体试验和药物依赖性抗体检测等；机械性损伤所致溶血性贫血在血片可检出异常形态红细胞和各种红细胞碎片。

1.红细胞膜缺陷溶血性贫血的检查

遗传性球形红细胞增多症血红蛋白和红细胞量正常或轻度减低，白细胞和血小板正常。血片中红细胞呈球形，大小比较均一，染色后细胞中央淡染区消失。网织红细胞增加。血涂片和阳性家族史有决定性诊断价值。红细胞渗透脆性增高，常于5.2~7.2g/L的低渗盐水开始溶解，4.0g/L完全溶解，孵育后脆性更高，加葡萄糖或ATP能够纠正。80%的患者红细胞膜电泳分析（SDS-PAGE电泳）可发现异常。目前应用分子生物学技术如用单链构象多态性分析（SSCP）、聚合酶链反应（PCR）结合核苷酸测序等可检出膜蛋白基因的突变位点。

遗传性椭圆形红细胞增多症有轻重不等的贫血。血片中椭圆形红细胞的比例大于25%。其形态呈椭圆形、卵圆形、棒状或腊肠形，红细胞横径与纵径之比小于0.78，硬度增加。骨髓红细胞系统增生活跃为增生性贫血骨髓象。红细胞渗透脆性试验和自身溶血试验多增高。红细胞膜蛋白电泳分析及低离子强度非变性凝胶电泳膜收缩蛋白分析出现异常结果有助于膜分子病变的确定。

2.红细胞酶缺陷性溶血性贫血的检查

红细胞G6PD缺陷症除遗传性非球形细胞溶血性贫血外，患者平时无明显异常改变，在诱因的作用下出现急性溶血时，有血管内溶血共同的实验室检测特征，而遗传性非球形细胞溶血性贫血具有慢性血管外溶血的实验室特征，红细胞形态一般无明显异常，可有少数异形或破碎的红细胞。G6PD缺乏的筛检试验均为阳性结果，在筛检试验中以荧光斑点试验的特异性最高，高铁血红蛋白还原试验的敏感性最强，但均不能准确检出红细胞G6PD缺乏的杂合子。G6PD活性定量检测能准确反映酶的活性，为G6PD缺陷症的确诊试验。通过同时测定G6PD和6PGD活性并计算G6PD/6PGD比值，可提高杂合子的检出率。

红细胞丙酮酸激酶缺陷症时红细胞自溶血试验阳性，加ATP可完全纠正，加葡萄糖不能纠正。PK荧光斑点试验中等缺乏者（杂合子型）25~60min荧光消失，严重缺乏者（纯合子型）60min荧光仍不消失。酶活性定量检测，中等缺乏者（杂合子型）为正常活性的25%~35%，严重缺乏者（纯合子型）为正常活性的25%以下。中间代谢产物测定可见2，3-二磷酸甘油酸（2，3-DPG）、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、2-磷酸甘油酸（2-PG）在PK缺乏时较正常增加2个标准差以上。

3.珠蛋白生成障碍性贫血的检查

一般溶血的检查：贫血轻重不等，红细胞大小不均，靶形红细胞和异形红细胞增多，多大于10%。进行溶血相关检测，红细胞脆性减低。珠蛋白生成障碍性贫血多为小细胞低色素性贫血，需与缺铁性贫血鉴别。

血红蛋白电泳：电泳技术无论是对珠蛋白肽链的结构异常还是肽链合成量的异常的诊断均有重要意义，选择适当的血红蛋白电泳技术可检测出各类异常血红蛋白及各血红蛋白成分的相对含量。各类珠蛋白生成障碍性贫血电泳结果见表1-9。

基因诊断：珠蛋白生成障碍性贫血均有基因突变，体外珠蛋白比率分析、基因探针及限制性内切酶图谱法、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、特异性寡核苷酸杂交法等检测进行基因分析可用于疾病的诊断和分型及骨髓移植和基因治疗的研究。通过对外周血或脐血进行基因诊断，可确定是否患病及具体的分子缺陷类型。通过对绒毛细胞或羊水细胞进行DNA诊断，对胚胎脐血进行基因诊断可进行产前诊断以防止纯合子患儿的出生。Α-珠蛋白生成障碍性贫血主要是α-珠蛋白基因缺失或突变所致。通过Southern印迹杂交分析和PCR方法检测其基因缺失。Β-珠蛋白生成障碍性贫血主要为点突变型，是一组高度异质性的遗传性疾病，应用寡核苷酸探针杂交技术和PCR-限制性内切酶酶解法可检测出已知的β珠蛋白生成障碍性贫血基因的突变。

4.异常血红蛋白病的检查

镰状细胞贫血（HbS病）：血红蛋白减低（一般为50~100g/L）。红细胞大小不均，可有小细胞、大细胞、裂红细胞、嗜多色红细胞、有核红细胞、靶形红细胞等。网织红细胞增加（常大于10%）。红细胞镰变试验阳性，红细胞渗透脆性明显下降。血红蛋白电泳可见HbS带位于HbA和HbA2间，结果显示HbS占80%以上，HbF增至2%~15%，HbA2正常，HbA缺乏。

血红蛋白E病：多为小细胞低色素性轻度贫血。红细胞渗透脆性减低。血红蛋白电泳显示HbE占75%~92%，HbE的电泳特征为在pH 8.6或8.8时，HbE移动速度较HbC稍快，与HbA2完全相同，不能分开；pH 6.8酸性凝胶电泳可与HbC和HbA2区分。因HbE不稳定，异丙醇沉淀试验阳性和热变性试验弱阳性；变性珠蛋白小体检测阳性。

不稳定血红蛋白病：变性珠蛋白小体检查出现阳性结果对疾病诊断有重要意义，热变性试验和异丙醇沉淀试验为阳性，一般用异丙醇试验筛选，再做热变性试验和变性珠蛋白小体检查进行诊断。血红蛋白电泳仅有部分病例可分离出异常血红蛋白区带。通过分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳，不稳定血红蛋白和潜在异常血红蛋白可清晰分离。

5.阵发性睡眠性血红蛋白尿症的检查

血细胞分析：贫血为几乎所有患者的表现，呈正色素性或低色素性贫血（尿中铁丢失过多时），网织红细胞增高，可见有核红细胞及红细胞碎片。白细胞和血小板多减少，半数患者为全血细胞减少。

骨髓象：半数以上的患者三系增生活跃，尤以红系造血旺盛。随病情变化表现不一，不同穿刺部位增生程度可明显差异，故增生低下者应注意穿刺部位，必要时做病理活检。

特殊溶血试验：尿含铁血黄素试验阳性为溶血存在的依据；热溶血试验、蔗糖溶血试验、酸化血清溶血试验阳性是补体敏感的红细胞存在的依据，蔗糖溶血试验是PNH的筛选试验，敏感但特异性较差。酸化血清溶血试验特异性高，多数患者为阳性，是诊断的重要依据。

流式细胞术检测：发现GPI锚连接蛋白（CD55或CD59）低表达的异常细胞群，支持PNH诊断。本试验是目前诊断PNH可定量的检测方法。

（三）常见疾病的实验室诊断

1.遗传性球形红细胞增多症

主要实验室诊断标准为：有家族史，典型临床症状和实验室检查（外周血球形红细胞大于10%、红细胞渗透脆性增加、MCHC升高、Ret增高），目前遗传性球形红细胞增多症无特异实验室检查，诊断时应结合病史、临床表现和实验室检查综合分析。应注意与自身免疫性溶血性贫血所致继发性球形细胞增多相鉴别，可做红细胞膜蛋白分析和组分定量，必要时采用基因序列分析的方法，寻找诊断依据和进行家系调查以鉴别诊断。

2.红细胞G6PD缺乏症

G6PD缺乏症是一种X连锁不完全显性遗传病，诊断依靠实验室检测红细胞G6PD活性的证据，临床表现及阳性家族史对诊断也非常重要。筛选试验中两项中度异常；或一项筛选试验中度异常加上Heinz小体生成试验阳性（有40%红细胞含Heinz小体，每个红细胞有5个以上Heinz小体）并排除其他溶血病因；或一项筛选试验中度异常，伴有明确的家族史；或一项筛检试验严重异常；或定量测定G6PD活性较正常平均值减低40%以上，均可确诊。并据不同发病情况对其进行临床分型。

3.红细胞PK缺乏

①PK荧光斑点试验结果为PK活性缺乏；②PK活性定量测定为纯合子范围；③PK活性定量测定为杂合子范围，伴有明显家族史和2，3-DPG两倍以上增高或中间代谢产物改变。符合以上三项中任何一项，支持PK缺乏的实验室诊断。遗传性红细胞PK缺乏症的诊断主要通过红细胞PK活性的测定进行诊断。在诊断时应注意与继发性PK缺乏进行鉴别并应考虑变异型的实验室诊断。

4.珠蛋白生成障碍性贫血

珠蛋白生成障碍性贫血是由于基因缺陷导致血红蛋白中至少一种珠蛋白合成缺乏或不足，引起的贫血或病理状态，是一组常染色体不完全显性遗传性疾病。根据缺乏的珠蛋白链的种类及缺乏程度给以命名和分类，珠蛋白生成障碍性贫血可分为α-珠蛋白生成障碍性贫血、β-珠蛋白生成障碍性贫血、δ-珠蛋白生成障碍性贫血和γ-珠蛋白生成障碍性贫血等。目前珠蛋白生成障碍性贫血的实验室检查主要包括血常规检测、血红蛋白电泳和定量分析、基因分析，而血红蛋白电泳的异常是确诊指标。

5.不稳定血红蛋白病

证明不稳定血红蛋白的存在是诊断本病的主要依据。应用热变性试验、异丙醇试验和变性珠蛋白小体试验可进行不稳定血红蛋白的常规检查，再结合临床表现可进行诊断。做有关珠蛋白链的氨基酸组成分析，可确定不稳定血红蛋白异常的部位。

6.阵发性睡眠性血红蛋白尿症

PNH是一种因体细胞PIG-A基因突变导致的获得性造血干细胞克隆性疾病。PIG-A基因突变导致血细胞膜上糖化磷脂酰肌醇（GPI）合成障碍，血细胞表面GPI锚连蛋白缺失，血细胞容易破坏而发生溶血。PNH的诊断标准（结合2013年中华医学会血液学分会红细胞疾病（贫血）学组制定的《阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断与治疗中国专家共识》）：临床表现符合PNH的特征，实验室检查结果如下具备①项或②项均可诊断，需与再生障碍性贫血、免疫性溶血性贫血和骨髓增生异常综合征等相鉴别。

①酸化血清溶血试验、糖溶血试验、蛇毒因子溶血试验、尿隐血（或尿含铁血黄素）试验等两项试验以上阳性，或一项试验阳性，但结果可靠有肯定的血管内溶血的直接或间接证据，并能除外其他溶血。

②流式细胞仪检查发现外周血中CD59或CD55阴性的中性粒细胞或红细胞大于10%（5%~10%为可疑）或气单胞菌溶素前体变异体检测阴性。